磺胺甲惡唑高效降解菌群的多樣性分析和降解微生物的分離表征

趙冬雪, 劉璐, 穆迎春, 韓剛, 張洪玉, 房洪博, 阮志勇, 宋金龍*

1.渤海大學食品科學與工程學院, 遼寧 錦州 121013；2.中國水產科學研究院, 北京 100141；3.黑龍江省博物館, 哈爾濱150001；4.中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所, 北京 100081

我國水產養殖量常年位居世界首位，巨大的產量主要依靠高密度養殖，該類養殖方式增加了水生動物病害的發生風險。抗菌藥物具有殺滅水產病原菌的效果，可有效抑制水產動物疾病。磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole，SMX)，又名新諾明，化學名為N-(5-甲基-3-異惡唑基)-4-氨基苯磺酰胺，可有效抑制水產養殖中嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、熒光假單胞菌和諾卡氏菌等引起的細菌性疾病，是目前水產養殖中最常用的廣譜抗菌藥物[1]。然而，隨著該藥物的大量使用，殘留污染問題越來越嚴重。磺胺甲惡唑中67%～90%不能被水生動物完全代謝，部分藥物以原形或代謝產物形式被排出體外，經養殖廢水和污水匯集，最終回流入地表水中[2]。養殖污廢水[3]、地表水[4-5]和地下水[6]等多種水體環境中均已檢出該藥物殘留，水生環境遭到威脅。而部分殘留在水生動物體內的藥物，一旦通過食物鏈進入人體，將對泌尿系統功能造成破壞，威脅人類健康[7-9]。2017年10月27日，世界衛生組織國際癌癥研究機構進一步將磺胺甲惡唑列為3類致癌物。因此，研究并解決當前水產養殖生產中頻發的磺胺類藥物藥害殘留問題，對保障水產品質量安全以及我國漁業綠色可持續發展具有重要價值。

國內外研究表明，磺胺甲惡唑的降解主要有物理法、化學法和微生物法，物理法包括吸附、光降解和熱降解等[1]。其中，微生物法具有成本低、生態環境友好和無二次污染等特點，被證明是目前修復養殖水體中磺胺甲惡唑殘留的有效方法[10]。迄今為止，已有超過20株可降解磺胺甲惡唑的微生物被報道，這些菌株在實驗室條件下都表現出優秀的降解能力。

磺胺甲惡唑濃度較低時，Ochrobactrumsp. SMX-PM1-SA1、Labryssp. SMX-W1-SC11和Gordoniasp. SMX-W2-SCD14對5 mg·L-1磺胺甲惡唑288 h的降解率為45.2%、62.2%和51.4%[11]，Phanerochaetechrysosporium[12]和PlanococcuskocuriiO516[13]對10 mg·L-1磺胺甲惡唑在72 h和24 h降解率為74.0%和20%。磺胺甲惡唑濃度較高時，Achromobactersp. JL9對50 mg·L-1磺胺甲惡唑120 h的降解率為63.1%[14]，硫酸鹽還原菌對200 mg·L-1磺胺甲惡唑192 h的降解率為21.3%[15]。此外，AchromobacterdenitrificansPR1[16]、Acinetobactersp.[17]、Pseudomonassp.[18]、Marinobactersp.[18]等菌株對磺胺甲惡唑也表現出了一定的降解能力。

綜上所述，已報道的菌株中大部分對高濃度磺胺甲惡唑耐受能力較差，降解效率較低，缺乏對降解后代謝產物和代謝途徑的研究。為進一步獲得磺胺甲惡唑高效降解菌株，本研究采用連續富集配合組學分析的研究方法，以期獲得高效磺胺甲惡唑降解菌，并進行最適環境條件優化，推測了其可能的降解途徑，為水產養殖環境中磺胺甲惡唑的去除提供了優良降解菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品采集 活性污泥樣品采自江蘇省蘇州市某藥廠廢水處理池，用于磺胺甲惡唑降解菌的分離。

1.1.2主要試劑 磺胺甲惡唑標準品購自索萊寶公司，純度為≥99.5%；甲醇，乙腈等試劑購自國藥集團化學試劑北京有限公司，實驗用水為高純水。

1.1.3培養基 無機鹽(MSM)培養基(g·L-1)∶K2HPO41.5，KH2PO40.5，NH4Cl 1，NaCl 1，MgSO4·7H2O 0.2，pH 7。Luria-Bertani(LB)培養基(g·L-1)：胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，NaCl 10，pH 7.2。

1.2 方法

1.2.1活性污泥中菌群的富集 以活性污泥樣品為初始接種物，進行微生物群落的富集。將5 g樣品加入盛有100 mL MSM培養基的三角瓶中，以50 mg·L-1磺胺甲惡唑為唯一碳源，置于恒溫振蕩器(30℃、150 r·min-1)培養7 d，后按10%(體積質量分數)接入新鮮無機鹽培養基，并將磺胺甲惡唑的濃度提升1倍，連續傳代4次，最終使富集物中的磺胺甲惡唑濃度達到300 mg·L-1，將每個代次的富集培養物分別命名為SMX1、SMX2、SMX3和SMX4[19]。

1.2.2富集培養物微生物群落組成和區系變化分析 運用Omega土壤細菌總DNA試劑盒對活性和富集樣品行了總DNA提取，純化回收后進行了16S rRNA V3-V4區擴增。通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)，806R(5′-GGA-CTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR體系參照王亞妮等[20]的方法進行。PCR產物純化回收后，送交百邁克基因科技公司進行文庫構建和高通量測序。對獲得的序列數據進行OTU(operational taxonomic units)物種注釋，分析每個代次群落菌群豐度變化，比較菌群組成結構差異。

1.2.3磺胺甲惡唑降解菌的分離 根據對富集物菌群組成和區系變化的分析，選擇第4代富集樣品開展磺胺甲惡唑降解菌的分離。將100 μL富集樣品均勻涂布在含有100 mg·L-1磺胺甲惡唑的MSM固體平板上，挑選形態不同且生長良好的菌落，通過連續多次劃線純化分離磺胺甲惡唑降解菌。

1.2.4磺胺甲惡唑降解菌的鑒定 對分離到的降解菌株進行全基因組提取，方法參照(Omega)細菌總DNA提取說明書進行。純化回收后，以菌株總DNA為模板進行16S rDNA擴增，通用引物分別為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′ACGGHTACCTTGTTTACGACTT-3′)。PCR擴增體系和反應條件與王亞妮等[21]的方法一致。對PCR產物回收后送交博邁德科技有限公司進行測序。獲得序列后運用Clustal X軟件進行多序列比對分析，并運用MEGA 6.0軟件構建系統發育樹。

1.2.5磺胺甲惡唑降解試驗 將分離到的菌株接種于LB培養基中，置于恒溫振蕩器(30 ℃、150 r·min-1)培養12 h，取10 mL菌液加入離心管后，以6 000 r·min-1離心并棄上清液，沉淀菌體部分用無菌生理鹽水洗滌3次后備用。降解試驗采用100 mg·L-1磺胺甲惡唑的初始濃度，以1%菌體量接種，研究降解菌在MSM培養基中對磺胺甲惡唑的降解效果。磺胺甲惡唑殘留運用高效液相色譜(Agilent 1290，USA)檢測，采用Eclipse Plus C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱；流動相A為0.1%甲酸(體積分數)，B為甲醇。靶向篩查梯度洗脫程序：0～2 min，95% A；2～25 min，95%～5% A；25～35 min，5% A；35～40 min，95% A；進樣量為20 μL,柱溫30 ℃[22]，通過標準曲線換算出培養液中磺胺甲惡唑濃度，計算降解能力[23]。

1.2.6環境因素對LLE3降解效率的影響 分別設置不同的培養溫度(15、20、25、30、35、40和45 ℃)，不同MSM培養基初始pH(4、5、6、7、8和9)以及不同初始接種量(1×107、2×107、3×107、5×107、8×107和10×107CFU·mL-1)研究環境因素對菌株LLE3降解能力的影響。

1.2.7菌株LLE3降解磺胺甲惡唑的代謝產物鑒定 運用液相和高分辨率質譜聯用檢測菌株LLE3的代謝產物。將菌株LLE3降解磺胺甲惡唑的培養液10 mL與等體積甲醇加入離心管中，在渦旋混合儀上均勻混合1 min。隨后將離心管放入搖床中以220 r·min-1混合30 min，再將離心管以5 000 r·min-1離心5 min。吸取上層有機相，并用0.22 μm孔徑的濾膜過濾。采用Waters液質聯用檢測，具體條件為，Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100.0 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流速為0.2 mL·min-1，流動相A為0.1%甲酸(體積分數)，B為甲醇。靶向篩查梯度洗脫程序：0～2 min，95% A；2～25 min，95%～5% A；25～35 min，5% A；35～40 min，95% A；進樣量為20 μL，柱溫30 ℃[14]。質譜條件DuoSprayTM離子源，電噴霧電離(ESI)，正離子模式掃描，離子源溫度為550 ℃；噴霧電壓為5 500 V，去簇電壓(DP)為65 V；霧化氣(GS1)為60 psi；輔助霧化氣(GS2)為60 psi；氣簾氣(CUR)為35 psi。積累時間為0.25 s，信息依賴性掃描(IDA)模式；IDA觸發15個子離子掃描；碰撞電壓為(35±15)eV，TOF MS進行全掃描，TOF MS/MS進行二級子離子掃描。

2 結果與分析

2.1 磺胺甲惡唑降解菌群組成和區系變化分析

經高通量測序污泥樣品和4代富集培養物SMX0、SMX1、SMX2、SMX3和SMX4，分別獲得了5 978、6 012、6 048、6 005和6 003個有效序列。經統計分析和OTU注釋，結果(圖1)表明污泥樣品SMX0中的6 015個基因序列被聚集成166個OTU，屬水平上總OTU比值由高到低主要分屬于BSV13、Lentimicrobium、Flavisolibacter、Ramlibacter和Rhodoferax。經過富集后，培養物SMX1中細菌多樣性迅速降低，6 005個序列僅聚集為23個OTU，主要菌群分屬于Pseudomonas、Sphingobacterium、Escherichia-Shigella、Alcaligenes和Sedimentibacter。2次傳代后，Sphingobacterium的總OTUs比值從8.92%提升到52.72%，逐漸成為優勢菌群。再經3、4次傳代后，最終富集物SMX4中6 003個序列聚類到16個OTU，細菌多樣性明顯降低，Sphingobacterium則成為絕對的優勢菌群，占總OTUs比值達93.68%。從整體上看，隨著磺胺甲惡唑初始濃度的增加，每個代次富集培養中的微生物多樣性逐漸降低，OTUs從最初的166個降至16個，菌群豐度和組成也發生了顯著改變，經4次連續富集后Sphingobacterium占OTUs總數比值高達93.68%，說明Sphingobacterium菌屬很有可能在SMX的降解中發揮重要作用，為進一步分離高效磺胺甲惡唑降解菌群提供了重要信息。

圖1 富集培養物中微生物屬水平相對豐度分布圖Fig.1 Relative abundance distribution of microbial genus level in enriched cultures

2.2 降解菌株的分離與鑒定

在富集培養物SMX4中分離到5株磺胺甲惡唑降解菌，分別命名為LLE1～5，其中LLE3和LLE5降解效果較好，且LLE3 在7 d內對100 mg·L-1的磺胺甲惡唑降解率達89.5%，因此，選擇菌株LLE3進行形態學、生理生化和16S rDNA鑒定。從菌落形態上看，菌株LLE3菌落表面光滑，邊緣整齊，呈檸檬黃色。在顯微鏡下，菌株LLE3呈短桿狀，長0.6～1.8 μm，寬0.3～0.6 μm，革蘭氏染色陰性。生理生化結果表明，菌株LLE3可以利用葡聚糖、D-麥芽糖、D-海藻糖、D-纖維、二糖龍膽、二糖、蔗糖、D-松二糖、水蘇糖等，但不能利用D-山梨醇、D-甘露醇和D-阿糖醇。將菌株LLE3的16S rRNA基因序列提交GenBank數據庫，序列登錄號為MW261785，BLAST結果表明，LLE3與水谷鞘氨醇桿菌(Sphingobacteriummizutaii) NCTC12149 16S rRNA 基因的相似性為99.09%，通過MEGA 6.0構建的系統發育樹中可以看出(圖2)，菌株LLE3與鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)的菌種匯聚在一起。因此，根據形態、生理生化和16S rRNA序列分析，初步將LLE3鑒定為水谷鞘氨醇桿菌(Sphingobacteriummizutaii)。

2.3 溫度對菌株LLE3降解效率的影響

本文研究了不同溫度梯度對菌株LLE3降解磺胺甲惡唑效率的影響。從圖3中可以看出菌株LLE3在15～40 ℃范圍內均可降解磺胺甲惡唑，溫度耐受性較好。其中，在25～35 ℃的區間內7 d時對初始濃度100 mg·L-1磺胺甲惡唑降解效率均達到60%以上，30 ℃時降解效率最高，達到了93.6%。當溫度低于20 ℃時降解效率明顯下降，在20 ℃和15 ℃時降解率分別為33.8%和56.7%。當溫度為40 ℃時，降解率為48.2%。由此可見，菌株LLE3具有一定的耐冷性，這也與鞘氨醇桿菌屬的其他菌株類似。

圖2 基于LLE3 16S rRNA序列構建的系統發育進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on LLE3 16S rRNA sequence

圖3 不同溫度對LLE3降解效率的影響Fig.3 Effect of different temperatures on the degradation efficiency of LLE3

2.4 初始pH對菌株LLE3降解效率的影響

pH是影響菌株降解效率的關鍵因素之一，不同pH對菌株降解影響的結果(圖4)表明，LLE3可以在pH為4～9的范圍內降解磺胺甲惡唑，最適pH為7，最高降解效率達到了92.2%。此外，LLE在pH為5～8的范圍內降解效率均超過50%，說明菌株LLE3在偏中性的條件下降解效率較高。當pH降低至4時，降解效率仍有35.5%，說明菌株對酸性條件具有一定的耐受性。當pH為9時，降解效率為42.4%，說明LLE3在偏酸、中性和偏堿的條件下均可使用。

圖4 不同pH對LLE3降解效率的影響Fig.4 Effect of different pH on the degradation efficiency of LLE3

2.5 初始接種濃度對菌株LLE3降解效率的影響

研究了不同初始接種濃度對菌株降解磺胺甲惡唑的影響，如圖5所示，當接種濃度為5×107CFU·mL-1時，菌株LLE3降解效率最高，為92.1%，且在初始接種濃度(2～8)×107CFU·mL-1的范圍內降解效率均超過90%，當接種量增加為8×107CFU·mL-1時降解效率為85%，10×107CFU·mL-1時降解效率為76.9%。由此可見，菌株LLE3在提高接種濃度時降解效率無明顯變化，初始接種量對菌株LLE3降解率影響較低。

圖5 接種量對LLE3降解效率的影響Fig.5 Effect of inoculation on the degradation efficiency of LLE3

2.6 菌株LLE3降解磺胺甲惡唑特性研究

研究了最適條件下菌株LLE3對磺胺甲惡唑的降解特性，從結果(圖6)中可知，菌株LLE3對磺胺甲惡唑的降解效率最高發生在1～4 d，在4 d時降解率達82.2%，而菌體濃度也相應達到了83.2×107CFU·mL-1，降解效率與菌體生長濃度呈正相關。5～7 d時，菌株LLE3進入了生長平臺期，相應的對磺胺甲惡唑降解速率逐漸降低，最終，菌株LLE3在7 d內對初始濃度為100 mg·mL-1的磺胺甲惡唑降解率達到了93.4%。本研究首次發現水谷鞘氨醇桿菌對磺胺甲惡唑具有較好的降解效果。

2.7 菌株LLE3降解磺胺甲惡唑代謝產物的研究

運用高效液相色譜與質譜聯用的方法，檢測了磺胺甲惡唑在MSM液體培養基中經菌株LLE3降解3 d后的代謝產物，結果如圖7所示。檢測到2個片段的質荷比分別為253和281 m·z-1，根據磺胺甲惡唑的化學結構以及質譜數據庫的推斷，質荷比253 m·z-1為磺胺甲惡唑母體化合物，降解質荷比為281 m·z-1的物質推斷為N-[4-(1，2-惡唑-3-基氨磺酰基)苯基]乙酰胺。該菌株主要是將磺胺甲惡唑一端的苯基上的氨基氧化為乙酰胺基，同時將甲惡唑環上的甲基去掉，從而成為最終的產物N-[4-(1，2-惡唑-3-基氨磺酰基)苯基]乙酰胺。

3 討論

鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium)為不產生芽孢的革蘭氏陰性細菌，廣泛存在于自然界中。Yabuuchi等[24]首次提出將Sphingobacterium單獨成屬以來，鞘氨醇桿菌屬的新種相繼被科研工作者們從不同的生境中發掘，如土壤、植物、動物，甚至心室體液、尿液等臨床樣本。其中，嗜溫鞘氨醇桿菌(Sphingobacteriumthalpophilum)和多食鞘氨醇桿菌(Sphingobacteriummultivorum)被報道具有石油烴的降解能力，如SphingobacteriummultivorumSWH-2具有較強的石油降解活性，并在該菌中發現了降解酶[25]。此外，雖然目前發現的大部分鞘氨醇桿菌都對多種抗生素具有抗藥性，但迄今為止，尚無鞘氨醇桿菌屬對抗菌藥物直接降解的相關報道。本研究分離的水谷鞘氨醇桿菌是第一次報道鞘氨醇桿菌屬可以降解磺胺甲惡唑。該菌的發現不但填補了鞘氨醇桿菌屬菌株的功能范圍，也為修復磺胺甲惡唑污染的養殖環境提供了寶貴的微生物資源。

圖6 LLE3降解磺胺甲惡唑降解特性Fig.6 Degradation characteristics of LLE3 degrading sulfamethoxazole

圖7 菌株LLE3降解磺胺甲惡唑產物的質譜圖Fig.7 Mass spectrum of the sulfamethoxazole degradation product by strain LLE3

近年來，研究人員已經從土壤、活性污泥、養殖水體中分離到了一批具有較好磺胺甲惡唑降解能力的菌株，如PlanococcuskocuriiO516[13]，Achromobactersp. JL9[14]，Phanerochaetechrysosporium[12]和Acinetobactersp.[17]等，與已報道的菌株相比較，菌株LLE3具有更佳的環境適應性和耐受性。從環境因素對降解效果影響的研究中可以看出，菌株LLE3在15～45 ℃、pH 4～9的范圍內均可降解磺胺甲惡唑，這對于將來該菌株在養殖環境中的實際應用提供了基礎。且生理生化結果顯示，LLE3可以利用多種碳源，可見該菌對環境的適應能力強，營養代謝類型豐富，具有降解其他復雜化合物的潛力。

現有報道結果表明，鞘氨醇桿菌屬的菌株大多都不能產生抗生素，但對抗生素具有抗藥性，這是鞘氨醇桿菌適應極端環境的重要因素[26]。抗生素是一類本身抑制微生物生長的化合物，因此降解菌首先需要具備抗生素的耐藥性。然而，有研究指出，Klebsiellapneumoniae能利用氯霉素作為唯一碳源進行生長，但是藥敏試驗發現這些菌株對氯霉素是敏感的，這表明細菌的耐藥過程和降解藥物過程是兩個獨立的途徑[27-28]。從菌株LLE3降解磺胺甲惡唑的產物來看，該菌主要是將磺胺甲惡唑一端的苯基上的氨基氧化為乙酰胺基，同時將甲惡唑環上的甲基去掉，從而成為最終的產物N-[4-(1，2-惡唑-3-基氨磺酰基)苯基]乙酰胺。說明該菌具有明確的磺胺甲惡唑的降解功能，不僅僅是具有較好的耐受性。雖然從降解產物上來看，該菌并不能完全礦化磺胺甲惡唑，但產生的代謝產物N-[4-(1，2-惡唑-3-基氨磺酰基)苯基]乙酰胺為首次報道，為研究微生物降解磺胺類藥物途徑的研究提供了一定參考。

本研究運用連續富集傳代結合高通量測序的方法，分析了磺胺甲惡唑降解富集物中微生物群落組成和變化，找出了與降解相關的核心微生物。進一步分離純化到了高效磺胺甲惡唑降解菌，經初步鑒定為SphingobacteriummizutaiiLLE3。通過單因素試驗確定了該菌最適的降解條件為30 ℃，pH 7，初始接種量5.0×107CFU·mL-1。該菌7 d內對磺胺甲惡唑降解效率為93.7%。菌株LLE3降解磺胺甲惡唑的主要代謝產物為N-[4-(1，2-惡唑-3-基氨磺酰基)苯基]乙酰胺，本研究為磺胺甲惡唑污染的生物修復提供了優良的微生物資源。