以回交重組自交系定位水稻萌芽期耐鎘脅迫相關QTLs

黃詩穎, 譚景艾, 王鵬, 蔣寧飛, 賀浩華,, 邊建民,*

1.江西農業大學, 作物生理生態與遺傳育種教育部重點實驗室; 江西省水稻高水平工程研究中心, 南昌 330045；2.浙江省建德市種子管理站, 浙江 建德 311600

目前，土壤重金屬含量超標已成為威脅作物生長發育及影響作物產量和質量的重要因素之一。鎘(Cd)是一種致使土質下降且生物毒性極強的重金屬[1]，水稻作為最主要的糧食作物之一，對Cd脅迫的耐受性較低。有關水稻在Cd脅迫下生長發育所受影響的研究，大多集中在Cd積累對于植株地上部分的影響，如影響光合效應[2]、抑制蒸騰作用[3]、干擾植物的代謝進程[3]、加速植株的衰老等[4]，即大多研究集中在生殖生長階段Cd脅迫對水稻植株的影響，但關于萌芽時期水稻對Cd脅迫耐受性的研究報道不多[5]。稻種萌芽后，根系與土壤接觸，是植物從土壤中吸收養分的重要介質[6]，而幼芽生長成為植株的地上部分，Cd的存在可抑制幼苗酶類活性，生理作用受到抑制，導致幼葉與根系細胞組分的嚴重缺失，影響生長[7]。稻種萌芽期對環境脅迫極其敏感，是水稻營養生長階段的基礎，因此，研究水稻萌芽期的耐Cd能力，對于挖掘水稻耐Cd作用機理與遺傳特點具有重要意義[8]。

Cd脅迫下水稻植株表現的性狀多為數量性狀[9]，定位耐Cd脅迫相關數量性狀基因座(quantitative trait loci，QTLs) 對于進行水稻Cd脅迫分子標記輔助育種具有重要意義。目前，水稻Cd積累QTLs定位研究多集中在苗期和成熟期，如利用回交重組自交系群體(recombinant inbred lines，RIL)及關聯分析等方法定位了水稻種子萌發和幼苗生長的Cd積累相關QTLs[10-14]；林輝鋒等[15]以Lemont和Dular雜交建立重組自交系群體，利用水培液共檢測到9個苗期耐Cd QTLs，其中位于1號染色體上的qRAP-1a與根長相關，可以解釋9%的表型變異。此外，研究人員以不同遺傳群體及檢測方法定位到一系列Cd積累相關的QTLs，并進行克隆，如利用鎘高積累品種Anjana Dhan和日本晴構建定位群體，克隆得到水稻低鎘積累基因OsHMA3[16]；利用臺中1號和春江06 2種差異明顯的品種構建雜交群體，克隆到1個調控水稻葉片Cd積累基因CAL1[17]。根據前人研究可知，水稻苗期Cd積累會影響植株葉綠素含量、葉長、根長、株高及干重等性狀[18]，但定位的鎘脅迫下控制水稻萌芽期根長、芽長的QTLs不多，水稻萌芽期種子的萌發狀況決定了植株后期的生長情況，最終影響產量，因此，研究水稻萌芽期種子Cd遺傳情況，定位萌芽期耐Cd脅迫的QTLs，對指導水稻耐Cd育種有重要作用[19]。

昌恢891是江西省主要的秈稻種質資源[20]，02428是廣親和的粳稻品種[21]，二者Cd脅迫耐受能力存在差異，基于此，本研究利用水稻02428和昌恢891衍生的124個回交重組自交系(backcross recombinant inbred lines，BIL)群體[22]，研究鎘脅迫水稻萌芽期根長、芽長的生長情況，并對稻種萌芽期耐Cd脅迫的QTLs進行定位，目的是初步解析水稻萌芽期Cd脅迫后根長、芽長遺傳機理，定位其中影響水稻萌芽期耐Cd脅迫的QTLs，以期為進行耐Cd水稻新品種的選育提供理論參考和基因資源。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1植物材料 植物材料由江西農業大學作物生理生態與遺傳育種重點實驗室提供。以粳稻品種02428為背景的BILs群體是利用02428與昌恢891雜交，通過與02428回交、自交，建立回交重組自交系群體。該群體包含124個家系[22]。

1.1.2實驗試劑及儀器 恒溫培養箱(日本PHCbi公司)；移液槍(德國Eppendorf公司)；NaClO溶液(天津大茂化學試劑廠)。

1.2 遺傳圖譜的構建

利用全基因組重測序技術對124個BILs家系進行基因分型。操作步驟為：提取親本與BILs群體的基因組DNA；利用物理法斷裂DNA并構建300 bp的文庫；通過華大基因MGISEQ-2000設備對文庫測序。基于測序結果進行單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)標記的篩選并進行分類，然后將連續多個SNP標記且具有相同的基因型概括為一個Bin標記[22]，利用這些Bin標記結合JoinMap 4.2軟件構建BILs群體的高密度圖譜。

1.3 形態指標考察

參考水稻生理實驗手冊[23]，隨機挑選健康飽滿的種子100粒，以1.5% NaClO溶液消毒30 min，而后以去離子水沖洗3次，再用蒸餾水浸泡24 h后，選擇露白的種子50粒于培養皿中進行脅迫處理。加17 mg·L-1的CdCl2溶液進行鎘脅迫處理(Cd)，以不加CdCl2溶液的處理作為對照組(CK)。培養7 d，其中，光照時間為14 h·d-1，黑暗時間為10 h·d-1，光照期間溫度為28 ℃，黑暗期間溫度為25 ℃，光照強度為360 μmol·m-2·s-1。測量芽長、根長2項形態指標[24]。試驗重復3次，取平均值用于QTL定位。

1.4 QTL定位

利用 QTL IciMapping V4.2軟件，采用復合區間作圖法，對 BIL 群體在全基因組范圍內檢測控制芽長、根長QTLs。將LOD值2.5定為閾值，若標記區間的LOD>2. 5，則認為該區間LOD值最高處所對應的位點為該性狀的1個QTL[25-26]。

1.5 數據分析

所有原始數據利用Microsoft Excel 2010進行分析；根長、芽長的數據利用t檢驗進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 遺傳圖譜的構建

利用全基因組重測序技術對124個BILs家系進行基因分型。與日本晴參考基因組相比，親本02428和昌恢891的SNP數分別為22 358和85 605。最終，在2個親本中共檢測到70 480個高質量SNP，進而對來自124個BIL群體的群基因組重新測序并利用產生的3 057個重組位點制作了連鎖圖譜。該圖譜的總遺傳距離為1 266.5 cM，12個水稻連鎖群的標記數和標記密度各不相同(圖1)。其中，8號染色體標記密度最高(0.24 cM·標記-1)。10號染色體標記密度最低(0.54 cM·標記-1)[22]。

圖1 BIL群體標記密度分布圖Fig.1 The high density map of the BIL population

2.2 水稻BIL群體耐鎘脅迫分析

為分析BIL群體Cd耐受力，將水稻萌發種子于溶液培養7 d，表1和圖2為BIL群體芽長、根長在Cd脅迫與水溶液處理下表型數據及分布。將對照組與Cd溶液處理組比較可知，02428相對芽長減少了30.65%，相對根長減少了81.48%；昌恢891相對芽長減少了20.46%，相對根長減少了82.49%。水溶液條件下，BIL群體芽長、根長變幅分別為0.28 cm和3.31 cm，標準差分別為0.53和1.82；Cd溶液條件下，BIL群體芽長、根長變幅分別為0.15 cm和0.40 cm，標準差分別為0.38和0.63。根長和芽長在Cd脅迫與水溶液處理下均表現為正態分布，可以用于QTL定位分析。

2.3 差異分析

為分析根長、芽長受Cd脅迫的影響，圖3為第7天所測根長、芽長的數據結果。Cd脅迫與對照組下的根長、芽長差異顯著(P<0.01)，這說明在Cd脅迫下稻種的萌發生育受到顯著抑制；同時，比較根長、芽長的Cd脅迫與對照組的差值可知，根長的差值較大，這說明在稻種萌芽期，Cd脅迫對于根長的抑制較芽長更明顯。

表1 鎘脅迫及水溶液處理下根長、芽長表現Table 1 Root and bud length performance under cadmium stress and aqueous solution

圖2 BIL群體根長芽長頻率分布圖Fig.2 BIL population root growth and shoot length frequency distribution diagram

注：**表示根長、芽長的Cd脅迫與對照組的差異極顯著(P<0.01)。圖3 處理第7天根長、芽長差異分析Fig.3 Correlation analysis of root length and shoot length on the seventh day of treatment

2.4 QTL定位

利用IciMapping V4.2軟件，結合已經構建的連鎖圖譜，對在鎘脅迫與水溶液處理下控制根長、芽長的QTLs進行分析，共檢測到7個QTLs(表2)，分別分布于第3、4、7、8、9染色體上，LOD值為2.70～5.21，貢獻率為6.45%～19.46%。

2.4.1根長QTL定位 鎘脅迫條件下，共檢測到1個控制根長的QTL，位于第7條染色體上，命名為qCdRL7，LOD值為5.21，貢獻率為19.46%，來自02428的等位基因，能增加水稻根長；水溶液條件下，檢測到1個控制根長的QTL，位于第4條染色體上，命名為qCKRL4，LOD值是2.85，加性效應為0.83，貢獻率是10.89%，來自昌恢891的等位基因，能增加水稻根長(表2)。

2.4.2芽長QTL定位 鎘脅迫條件下，共檢測到4個控制芽長的QTLs，分別位于第3、8、8和9染色體上，命名為qCdBL3、qCdBL8.1、qCdBL8.2和qCdBL9，LOD值分別為4.48、2.96、2.85和3.77，貢獻率分別為10.87%、6.90%、6.45%和8.76%。其中，qCdBL3、qCdBL8.1和qCdBL8.2增效等位基因來自02428，qCdBL9增效等位基因來自昌恢891。水溶液對照處理下，共檢測到1個控制芽長的QTL，命名為qCKBL8，位于第8條染色體，LOD值是2.70，貢獻率是10.53%，增效等位基因來自02428。

表2 鎘脅迫及水溶液處理下控制根長、芽長響應QTLTable 2 Response QTLs of root length and shoot length under cadmium stress and aqueous solution treatment

3 討論

前人研究表明，不同水稻品種耐Cd能力因基因型不同而存在差異[27]。研究顯示，在Cd脅迫下，粳稻02428芽長與根長均表現出更明顯的變幅，即萌發期Cd脅迫對粳稻02428抑制作用要明顯大于對秈稻昌恢891的抑制，表明萌發期秈稻、粳稻Cd耐受能力存在差異，證實水稻種子萌發期對Cd脅迫較為敏感[28]。本研究表明，Cd脅迫對秈稻昌恢891和粳稻02428萌發期芽長和根長均有顯著的抑制作用(P<0.01)，其中Cd對根長的抑制強于芽長，說明萌芽時期水稻不同部位受Cd抑制程度不同。

李煒星等[29]以秈稻品種昌恢121為輪回親本、粳稻品種越光為供體親本構建的CSSL群體，以根長、苗長等6個性狀指數為耐Cd指標，檢測到7個相關QTLs，其利用根長作為抗性指標所定位到的位于第7號染色體RM1306處的qTRFW7與本研究定位到的qCdRL7位置接近，說明第7條染色體上存在控制水稻萌芽期根長發育的QTL位點；Xue等[30]以秈稻ZYQ8和粳稻JX17為親本構建的DH群體，共定位到22個與幼苗期Cd耐性和積累相關的QTLs，其中以幼苗長度作為抗性指標定位的qSH8與本研究所定位到的鎘脅迫芽長相關QTLqCdBL8.2接近，表明第8號染色體153～154區段可能在著控制水稻全生育植株高度基因(QTL)。本研究檢測到位于第3號和9號染色體上控制芽長的qCdBL3和qCdBL9，在之前的研究中未被檢測到，可能是與幼苗期鎘脅迫相關的新QTLs。

本研究以Cd脅迫下根長、芽長指數作為指標，共檢測到5個Cd脅迫相關QTLs，根長、芽長未檢測到相同QTLs，說明鎘脅迫下控制水稻根長、芽長的遺傳機制可能存在差異，表明水稻耐鎘脅迫遺傳機制的復雜性，且于不同環境及不同群體所檢測到的基因位點存在較大差異。鎘脅迫和非鎘脅迫條件下定位的QTLs不同，表明Cd脅迫與正常環境下控制根長或芽長基因不同，這與李煒星等[29]和黃鳳林[31]的研究結果類似。此外，所檢測Cd脅迫相關QTLs的貢獻率為6.45%～19.46%，其中qCdRL7貢獻率最大，表明耐Cd脅迫雖然是數量性狀基因控制，但存在主效QTL。因此，在今后Cd脅迫分子育種中，選擇耐Cd主效QTL的同時應聚合更多耐Cd脅迫的QTLs，提高育種效率。本研究檢測的5個萌芽期耐Cd脅迫QTLs中，qCdBL3、qCdBL8.1和qCdBL8.2增效等位基因均來自于廣親和粳稻02428，因此在今后的育種中可以利用02428為中間材料，可通過連鎖分子標記，將這些水稻萌芽期耐Cd的QTLs導入其他水稻品種中，來提高水稻耐鎘能力；同理，增效等位基因均來自于秈稻昌恢891的qCdBL9，可通過連鎖分子標記，將其導入其他秈稻品種中，以此來提高秈稻的耐鎘能力。