十溴聯(lián)苯醚(BDE-209)短期暴露對(duì)成年期小鼠的免疫毒性研究

廖桃桃, 湯俊杰, 史瀟翔, 張偉杰, 茆廣華*, 吳向陽(yáng)*

1.江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013

多溴聯(lián)苯醚(polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)是一類典型的持久性有機(jī)污染物，作為常用的阻燃劑廣泛應(yīng)用于建筑、塑料、紡織和電子產(chǎn)品等行業(yè)[1-2]。2,2′,3,3′,4,4′,5,5′,6,6′-十溴聯(lián)苯醚(BDE-209)是PBDEs家族中使用量最大的一種，所占比例超過(guò)82%[3]。2017年《斯德哥爾摩公約》將BDE-209列為持久性有機(jī)污染物[4]，但其仍在各種環(huán)境介質(zhì)(灰塵、空氣、水體)、食品和人體樣本中普遍檢出[5-10]。研究表明，BDE-209具有生物蓄積性，其毒性效應(yīng)和潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)逐漸引起人們的廣泛關(guān)注。目前，針對(duì)BDE-209毒性效應(yīng)的研究表明，BDE-209可引起動(dòng)物和人體的各種系統(tǒng)毒性，包括發(fā)育神經(jīng)、生殖和內(nèi)分泌系統(tǒng)毒性等[11-13]。BDE-209對(duì)免疫系統(tǒng)的毒性也有相關(guān)報(bào)道。Feng等[14]發(fā)現(xiàn)，小鼠口服800 mg·kg-1BDE-209兩年可引起多種器官的組織病理學(xué)改變。Zeng等[15]研究表明，BDE-209(口服800 mg·kg-1，超過(guò)7個(gè)月)可減少白細(xì)胞數(shù)量、抑制CD8 T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而引起免疫毒性。然而，這些從不同角度評(píng)估免疫毒性的研究缺乏系統(tǒng)性及多指標(biāo)的綜合分析評(píng)價(jià)，且關(guān)于機(jī)體短期暴露于BDE-209是否可自行恢復(fù)的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)(integrated biomarker responses, IBR)是一種可通過(guò)簡(jiǎn)單計(jì)算將多種生物標(biāo)志物轉(zhuǎn)化為單個(gè)指標(biāo)的綜合分析方法[16]。通過(guò)綜合分析，IBR可避免由于不同生物標(biāo)志物的不同步而導(dǎo)致的評(píng)估結(jié)果偏差。過(guò)去幾十年，IBR被廣泛應(yīng)用于生態(tài)和醫(yī)療研究領(lǐng)域[17-19]?，F(xiàn)今，IBR也逐漸應(yīng)用于毒理學(xué)領(lǐng)域，但主要集中于水生毒理學(xué)研究，缺乏在嚙齒動(dòng)物毒理學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用[20-22]。因此，本研究通過(guò)建立成年期雌性Balb/c小鼠BDE-209暴露模型，考察其對(duì)臟器指數(shù)、免疫球蛋白、淋巴細(xì)胞增殖、脂質(zhì)過(guò)氧化等免疫指標(biāo)的影響，并用IBR結(jié)合其他分析方法對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行綜合性評(píng)估，通過(guò)綜合性評(píng)價(jià)指標(biāo)揭示短期BDE-209暴露的免疫毒性及機(jī)體的自體修復(fù)情況，該研究可為BDE-209的免疫毒性評(píng)估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對(duì)人類健康具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1藥品與試劑 BDE-209(CAS No.1163-19-5)購(gòu)自上海甄淮生物科技有限公司(以大豆油為溶劑，配置成濃度梯度為0.6、6和60 mg·mL-1的BDE-209大豆油溶液)；胎牛血清(FBS)和懸浮細(xì)胞1640 培養(yǎng)基(RPMI 1640)購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；脂多糖(LPS)、刀豆蛋白A(ConA)、噻唑蘭(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；IFN-γ、IL-4、IgG酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自合肥博美生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；RNA提取試劑盒購(gòu)自Takara公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和DNA擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自羅氏公司。

1.1.2動(dòng)物與分組 清潔級(jí)8周齡 Balb/c 雌性小鼠80只，體重(18±2)g，購(gòu)自江蘇大學(xué)動(dòng)物中心，于實(shí)驗(yàn)前檢疫3 d，飼養(yǎng)溫度(23±1)℃，濕度60%±5%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分組，每組20只，于產(chǎn)后(postnatal day，PND)56～76 d暴露于BDE-209。實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組(玉米油)、BDE-209高劑量組(400 mg·mL-1BDE-209)、BDE-209中劑量組(40 mg·mL-1BDE-209)和BDE-209低劑量組(4 mg·mL-1BDE-209)，灌胃量為0.2 mL·30 g-1·d-1，每天1次，連續(xù)給藥21 d。分別于給藥結(jié)束后的第1 d(PND77)和第21 d(PND98)進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

1.2 方法

1.2.1成年期BDE-209暴露對(duì)小鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響 末次給藥后第1 d 和第21 d，取小鼠眼球血于抗凝管中混勻，用于白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞比率、紅細(xì)胞及血小板分析。

1.2.2成年期BDE-209暴露對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響 末次給藥后第1 d 和第21 d，脫頸處死。取出脾臟和胸腺并稱重記錄，按照公式計(jì)算臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)(mg·g-1)=臟器重量(mg)/體重(g)

1.2.3成年期BDE-209暴露對(duì)小鼠血清IgG的影響 末次給藥后第1 d和第21 d，小鼠眼后靜脈叢取血，3 000 r·min-1離心10 min，取上層血清，采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定血清中IgG的含量。

1.2.4成年期BDE-209暴露對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的影響 脾細(xì)胞懸液的制備參考Li等[23]的方法。調(diào)整脾細(xì)胞懸液濃度為5×106個(gè)·mL-1，接種于96孔板，100 μL·孔-1。分別向每孔中加入ConA液(10 μg·mL-1，100 μL)或LPS液(20 μg·mL-1，100 μL)，對(duì)照孔加入等量培養(yǎng)液，每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔。于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，采用MTT法于570 nm處測(cè)定其OD值。

1.2.5成年期BDE-209暴露對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響 按照1.2.4的方法制備脾細(xì)胞懸液，接種于24孔板，200 μL·孔-1，培養(yǎng)48 h后，1 000 r·min-1離心10 min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定IFN-γ和IL-4的含量。

1.2.6成年期BDE-209暴露對(duì)小鼠脂質(zhì)過(guò)氧化的影響 末次給藥后第1 d和第21 d，分別取脾臟和胸腺各200 mg置于10 mL離心管中，加入適量的生理鹽水，制成10%的組織勻漿液，3 000 r·min-1離心10 min后，取上清液，根據(jù)試劑盒說(shuō)明測(cè)定MDA和SOD的含量。

1.2.7成年期BDE-209暴露對(duì)小鼠脾臟IFN-γ和IL-4 mRNA表達(dá)的影響 末次給藥后第1 d和第21 d，小鼠脫頸處死，取其脾臟，去除結(jié)締和脂肪組織后，按照Trizol試劑盒要求提取總RNA，Nanodrop2000測(cè)定總RNA濃度。按照Takara試劑盒要求將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-80 ℃保存。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，用LightCycler 96熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量分析。

表1 qPCR研究中引物序列Table 1 Primers sequences in the qPCR study

1.3 IBR計(jì)算

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示，采用Turkey檢驗(yàn)方法用于實(shí)驗(yàn)中各暴露組與對(duì)照組之間差異的顯著性比較，P<0.05表示暴露組與對(duì)照組之間有顯著性差異。析因分析、主成分分析結(jié)合IBR用于指標(biāo)的綜合分析，其中析因分析中P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 成年期BDE-209暴露對(duì)小鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響

如表2所示，在PND77時(shí)，與空白對(duì)照組相比，小鼠白細(xì)胞數(shù)量及淋巴細(xì)胞比率均呈下降趨勢(shì)，并在中高劑量組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。PND98時(shí)，BDE-209暴露引起的血常規(guī)指標(biāo)異常均得到恢復(fù)，且與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，提示小鼠在切斷暴露源后可得到一定程度的自我修復(fù)。

2.2 成年期BDE-209暴露對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響

如表3所示，與空白對(duì)照組相比較，PND77時(shí)各暴露組小鼠的脾臟和胸腺指數(shù)均呈下降趨勢(shì)，且在中高劑量組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P< 0.05或P< 0.01)。停止暴露21 d后(即PND98時(shí))，各暴露組臟器指數(shù)均得到一定程度的恢復(fù)且與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。可見(jiàn)，中、高劑量BDE-209暴露可引起小鼠免疫器官的萎縮，但該毒性效應(yīng)可通過(guò)機(jī)體自我修復(fù)得到改善。

2.3 成年期BDE-209暴露對(duì)小鼠血清IgG的影響

如圖1所示，短期低、中劑量BDE-209暴露可顯著增加小鼠血清IgG含量(P< 0.01)，停藥21 d各劑量組IgG含量與空白對(duì)照組無(wú)顯著差異，提示該免疫刺激作用可在暴露源清除后得到改善。

表2 成年期BDE-209暴露對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響Table 2 Effect of BDE-209 exposure on organ index of adult mice

表3 成年期BDE-209暴露對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響Table 3 Effect of BDE-209 exposure on organ index of adult mice

注：**表示與空白對(duì)照組相比，差異在P<0.01水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖1 成年期BDE-209暴露對(duì)小鼠血清IgG的影響Fig.1 Effect of BDE-209 exposure on IgG secretion from serum in adulthood mice

2.4 成年期BDE-209暴露對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖的影響

由圖2可知，PND77時(shí)，BDE-209可不同程度抑制ConA和LPS誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，與對(duì)照組相比，各暴露組均具有顯著的抑制作用(P<0.01)。PND98時(shí)，BDE-209暴露所致的脾淋巴細(xì)胞增殖能力降低得到改善且與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異，表明BDE-209暴露所致的成年期小鼠細(xì)胞免疫損傷可隨著暴露源清除得到改善。

2.5 成年期BDE-209暴露對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

由圖3可知，BDE-209暴露21 d可抑制小鼠淋巴細(xì)胞IFN-γ的分泌，促進(jìn)IL-4的分泌，且高劑量組與空白對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。暴露結(jié)束21 d后，二者均得到改善，但與對(duì)照組相比，高劑量組IL-4的分泌量與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示BDE-209暴露對(duì)IFN-γ和IL-4的影響可在暴露源清除后得到一定程度的恢復(fù)。

2.6 成年期BDE-209暴露對(duì)小鼠脂質(zhì)過(guò)氧化的影響

由圖4可知，PND77時(shí)，BDE-209可顯著增加脾臟和胸腺組織中MDA含量，降低SOD活性(脾臟40 mg·kg-1和400 mg·kg-1，P<0.01；胸腺，400 mg·kg-1，P<0.01)。PND98時(shí)，高劑量組可顯著增加組織MDA含量(P<0.01)，并顯著降低胸腺SOD活性(P<0.01)，表明BDE-209暴露對(duì)小鼠脂質(zhì)過(guò)氧化的影響較難在暴露源清除后得到恢復(fù)。

注：**表示與空白對(duì)照組相比，差異在P<0.01水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖2 成年期 BDE-209 暴露對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of BDE-209 exposure on splenocyte proliferation in adult mice

2.7 成年期BDE-209暴露對(duì)小鼠脾臟IFN-γ和IL-4 mRNA表達(dá)的影響

由圖5可知，PND77時(shí)，中、高劑量BDE-209可顯著促進(jìn)小鼠脾臟IFN-γ和IL-4 mRNA表達(dá)(P< 0.01)。PND98時(shí)，IFN-γ和IL-4 mRNA表達(dá)與空白組相比均未見(jiàn)顯著性差異。由此可知，BDE-209暴露對(duì)IFN-γ和IL-4 mRNA表達(dá)具有一定的促進(jìn)作用，但在停止暴露后可通過(guò)自我修復(fù)得到一定程度的恢復(fù)。

2.8 綜合分析

2.8.1主成分分析(PCA) 由表4可知，所有特征值為1以上的保留因子共3個(gè)，累積貢獻(xiàn)率達(dá)到82.085%，說(shuō)明PCA成功將13個(gè)變量成功降維變成3個(gè)因子，且這3個(gè)因子保留了全部數(shù)據(jù)82.085%的信息。由表5可知，在第一主成分的特征向量中，荷載較高(>0.7)的指標(biāo)有IFN-γ mRNA、IL-4 mRNA、淋巴IL-4、脾臟SOD、脾臟MDA、脾臟指數(shù)、淋巴IFN-γ；在第二主成分的特征向量中，荷載較高(>0.7)的指標(biāo)有B細(xì)胞增殖、T細(xì)胞增殖；在第三主成分的特征向量中，荷載較高(>0.7)的指標(biāo)有IgG。

2.8.2IBR分析 圖6中的3個(gè)方向軸表示3種生物標(biāo)志物(IgG、B細(xì)胞增殖、淋巴IL-4)，星狀圖圍成的面積為IBR值。從圖6中可以看出，在同一暴露劑量下，PND98的IBR值小于PND77的IBR值；與空白對(duì)照組比較，暴露劑量組IBR增大。表明BDE-209對(duì)成年期小鼠具有免疫毒性，但在停止暴露21 d后機(jī)體可通過(guò)自我修復(fù)降低該免疫毒性效應(yīng)。

注：**表示與空白對(duì)照組相比，差異在P<0.01水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖4 成年期BDE-209暴露對(duì)小鼠抗氧化能力的影響Fig.4 Effect of BDE-209 exposure on anti-oxidation capacity of adulthood mice

注：**表示與空白對(duì)照組相比，差異在P<0.01水平上具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖5 成年期BDE-209暴露對(duì)小鼠脾臟中IFN-γ、IL-4基因表達(dá)的影響Fig.5 Effect of BDE-209 exposure on IFN-γ and IL-4 mRNA expression in splenocytes in adult mice

圖6 不同濃度BDE-209暴露后成年期小鼠IBR星狀圖Fig.6 IBR of adult mice exposed from different concentration of BDE-209

表4 元件提取結(jié)果Table 4 The results of component extraction

2.8.3析因分析 由表6可知，BDE-209劑量和是否度過(guò)恢復(fù)期對(duì)IgG、B細(xì)胞增殖、T細(xì)胞增殖、脾臟MDA、脾臟SOD、淋巴IL-4、IFN-γ mRNA、IL-4 mRNA具有極顯著的交互性(P<0.01)，對(duì)脾臟指數(shù)、淋巴IFN-γ具有顯著的交互性(P<0.05)，說(shuō)明針對(duì)這些指標(biāo)，BDE-209暴露毒性與劑量相關(guān)，并且可在停藥21 d后得到有效改善。

表5 旋轉(zhuǎn)元件矩陣Table 5 Rotated component matrix

表6 析因分析結(jié)果Table 6 The results of factorial analysis

3 討論

胸腺和脾臟是重要的免疫器官，其指數(shù)變化可在一定程度上反映機(jī)體的免疫功能。BDE-209暴露降低了小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，表明其可導(dǎo)致胸腺和脾臟萎縮。Kreutz等[25]研究發(fā)現(xiàn)，暴露于農(nóng)藥成分的魚(yú)比正常魚(yú)的免疫球蛋白水平更高，揭示免疫刺激效應(yīng)的有害性。因此，研究中發(fā)現(xiàn)的IgG水平升高，提示BDE-209暴露對(duì)成年期小鼠的免疫毒性。ConA誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖，LPS誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞增殖，研究發(fā)現(xiàn)BDE-209顯著抑制PND77的T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的增殖，這與上述脾臟和胸腺萎縮的相關(guān)結(jié)果是一致的。Liu等[26]研究發(fā)現(xiàn)，暴露于BDE-209的大鼠淋巴細(xì)胞增殖受到抑制，這與我們的結(jié)果相似。

為了進(jìn)一步探究BDE-209的免疫功能障礙，此次研究檢測(cè)了胸腺和脾臟中的MDA和SOD水平。結(jié)果表明，BDE-209可提高M(jìn)DA水平，降低SOD活性。先前對(duì)于BDE-209的甲狀腺毒性研究發(fā)現(xiàn)，BDE-209可對(duì)甲狀腺產(chǎn)生類似影響[27]。本團(tuán)隊(duì)已有研究表明BDE-209可通過(guò)氧化損傷產(chǎn)生免疫毒性，這與先前研究發(fā)現(xiàn)的機(jī)體對(duì)環(huán)境壓力異常的應(yīng)激反應(yīng)和免疫毒性誘導(dǎo)反應(yīng)一致[28]。

Th1型細(xì)胞因子IFN-γ是主要的促炎細(xì)胞因子，Th2型細(xì)胞因子IL-4是主要的抗炎細(xì)胞因子。先前研究表明，在一些感染性、自身免疫性/炎癥性、過(guò)敏性(特應(yīng)性)和腫瘤性疾病中，促炎和抗炎性細(xì)胞因子之間存在嚴(yán)重的不平衡[29]。此次研究發(fā)現(xiàn)，BDE-209暴露對(duì)IFN-γ分泌具有抑制作用，對(duì)IL-4分泌具有促進(jìn)作用，提示對(duì)Th1反應(yīng)的下調(diào)和對(duì)Th2反應(yīng)的上調(diào)，反映了潛在的Th1/Th2失衡。IFN-γ基因表達(dá)與細(xì)胞因子分泌的變化趨勢(shì)相反，推測(cè)是機(jī)體的負(fù)反饋調(diào)節(jié)所致。盡管IFN-γ與IL-4基因表達(dá)的變化趨勢(shì)相同，但其變化程度不同，表明存在潛在的Th1/Th2失衡。

BDE-209對(duì)小鼠的影響經(jīng)自我修復(fù)21 d后，所檢測(cè)指標(biāo)均趨向正常水平。相比空白對(duì)照組，臟器指標(biāo)、IgG、脾淋巴細(xì)胞增殖及Th1/Th2相關(guān)基因mRNA水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異。低劑量組細(xì)胞因子分泌水平及SOD、MDA水平恢復(fù)正常，中、高劑量組差異仍有顯著性。這些結(jié)果表明，BDE-209對(duì)成年小鼠的體液免疫和脂質(zhì)過(guò)氧化具有較持久的影響，且主要發(fā)生在中、高劑量暴露下。

IBR可通過(guò)簡(jiǎn)單的多元圖形方法(星狀圖)將各種生物標(biāo)記物變化進(jìn)行可視化。析因分析不僅可以檢驗(yàn)各因素水平之間的差異，而且可以檢驗(yàn)各因素之間的交互作用。為了全面分析BDE-209的免疫毒性，以及短期暴露于BDE-209是否可以通過(guò)停藥后自我修復(fù)來(lái)降低其免疫毒性，可采用IBR和析因分析進(jìn)行綜合分析。PCA通過(guò)減少維數(shù)而不丟失重要信息來(lái)分析數(shù)據(jù)，此次研究考慮到大量的指標(biāo)，使用它來(lái)選擇用于IBR分析的生物標(biāo)記物。經(jīng)PCA分析，選擇保留85.821%信息的3個(gè)主成分。選取3個(gè)與這3個(gè)主成分密切相關(guān)的生物標(biāo)志物(IgG、B細(xì)胞增殖、淋巴IL-4)進(jìn)行IBR分析。鑒于BDE-209暴露結(jié)束21 d后各組的IBR值均明顯小于暴露結(jié)束時(shí)的IBR值，推測(cè)小鼠具有良好的自我修復(fù)能力。析因分析結(jié)果顯示，對(duì)于多項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)，BDE-209的暴露劑量和是否度過(guò)恢復(fù)期之間存在交互影響，說(shuō)明小鼠在切斷暴露源后可有效降低BDE-209的毒性作用。這一結(jié)果與我們觀察到的PND98大多數(shù)指標(biāo)趨于正常一致。

綜上，短期BDE-209暴露對(duì)成年期小鼠具有免疫毒性，但機(jī)體可在切斷暴露源后通過(guò)自我修復(fù)得到一定程度的恢復(fù)。