肝臟類器官的研究及應用進展

肖金平, 曹云娣, 李程, 孫志堅

浙江科途醫學科技有限公司, 浙江 湖州 313000

類器官(organoids)是一種通過體外模擬器官微環境，由干細胞或其衍生而來的各種類型細胞經三維(3-dimensional，3D)培養形成的器官特異性細胞集合[1]。作為體外形成的一種3D細胞簇，類器官不僅具有自我更新和自我組織的能力，并且能夠重現器官的體內功能[2-3]。近年來，類器官培養技術取得了重大進展，其中已報道的包括胰腺[4]、腸[5]、胃[6]、肺[7]和前列腺[8]等多種類器官的構建及應用，不僅在體外可連續傳代，而且能保持相對穩定的遺傳學特征和表型[9]。

不同病因所致的肝病死亡已成為全球疾病死亡的主要原因之一，由于肝細胞在體外培養的增殖能力有限[10]；同時，細胞株、細胞系、小鼠等構建的肝臟疾病模型在遺傳代謝機制上和人具有較大差異，使其研究結果較難向臨床轉化；在體外肝細胞分子機制和藥物療效的研究中通常采用二維(2D)培養的肝細胞作為研究模型，但2D單層培養環境容易迫使肝細胞適應塑料表面環境，進而影響肝細胞的重要代謝途徑，引起細胞骨架變化，使其失去細胞極性和酶活性，同時無法再現體內肝細胞的結構、生理和功能特征[11-12]。而3D培養技術擺脫了上述條件的限制，在肝細胞疾病建模、肝臟移植及藥物發現等方面具有較大的應用前景。

1 肝臟類器官技術的發展

長久以來，體外長期培養和擴增人源肝細胞一直是制約肝臟疾病基礎和臨床轉化研究的瓶頸[10-13]。目前人源肝臟類器官可由永生化細胞系、干細胞及肝臟原代細胞等多種來源的細胞，在體外通過懸浮球體培養、基質膠、支架等構建。本文著重對干細胞、成纖維細胞轉分化和肝臟原代細胞此三種細胞來源的肝臟類器官進展進行探討。

1.1 干細胞來源的肝臟類器官

干細胞是一種具有多種分化潛能的細胞群，是機體組織、器官再生的基礎[14]。干細胞來源的肝臟類器官主要由兩種類型的干細胞產生：胚胎干細胞(embryonic stem cell, ES細胞)和誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)。

研究發現，通過誘導小鼠或人的ES細胞可定向分化形成類肝細胞，其分化效率高達70%～80%[15]。據報道，通過ES細胞分化形成的類肝細胞具有上皮細胞樣形態，能夠實現糖原積累、分泌肝臟功能蛋白ALBUMIN、轉運ICG等肝功能，部分具有CYP450酶活性[16-17]。該來源的類肝細胞可用于HCV病毒感染，且可整合至CCL4誘導、Fah缺陷、DPP4缺陷的小鼠肝損傷模型中[18-19]。ES細胞雖然經過誘導后能獲得CYP450酶的一些特定的肝臟功能，但在藥物代謝能力方面與原代肝臟細胞卻相差很大，需要改進分化或培養條件才能達到研究所需要求，且該類細胞分化后一般會混雜未分化的細胞，很容易在移植時形成畸胎瘤，同時在異體細胞移植時易存在免疫排斥等問題[15, 20-21]。

iPSC來源的肝臟類器官主要通過逐步誘導分化的方式形成。研究發現利用特異性過表達轉錄因子對小鼠/人成體細胞誘導后利用重編程技術形成的iPSC細胞也具有上皮樣細胞形態，能夠實現糖原積累、分泌肝臟功能蛋白ALBUMIN及吸收ICG等功能[22-23]。但2011年，有研究者將iPSC通過誘導分化形成數量較多的類肝實質細胞移植入由二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine，DMN)誘導的肝纖維化小鼠體內后，其整合效率僅為8%～15%，且移植后的小鼠體內含人ALBUMIN的濃度極低，表明通過此誘導方法形成的類肝實質細胞中大部分肝細胞并不具有成熟的肝功能[24]。隨后，Takebe等[25]于2013年將iPSC來源誘導的肝細胞和人靜脈內皮細胞及間充干細胞于基質膠平板上共培養后形成了類似于肝芽組織的聚合物，該3D聚合物成為了最初由iPSC源性肝細胞類器官雛形。自此經過不斷優化和改進，通過將iPSC逐步誘導形成終末內胚層，然后到前祖細胞，最后形成肝細胞后。Ogawa等[26]通過加入維甲酸、成纖維細胞生長因子10、活化素A等誘導iPSC向膽管細胞類器官分化。Sampaziotis等[27]通過添加抑瘤素M、肝細胞生長因子等使其向肝細胞類器官分化。2017年Wu等[28]通過向iPSC來源的類器官經典培養基中添加25%的MTeSR(主要成分為維生素C、成纖維細胞生長因子2等)使其向內胚層及小部分中胚層分化，實現了肝細胞樣細胞和膽管細胞樣細胞的共分化，并在最后培養階段加入膽固醇混合物顯著促進了肝-膽類器官的形成與成熟。

然而，多能干細胞在培養過程中需要添加多種生長因子進行誘導分化形成肝臟類器官和促進該類器官成熟，該過程耗時較長，且存在成本較高、誘導和培養過程中容易因人為因素造成前后形成的肝臟類器官結構不一致等問題。同時，人們發現多能干細胞形成的類器官在培養過程中存在生長停滯、組織特征表現異常的問題，使其在生物醫學領域的應用受到了限制[29-30]。2020年Jeremy等[31]通過基因調控網絡(gene regulatory networks，GRN)系統技術和CRISPR技術在體外17 d內即可構建出具有血液系統和4種主要細胞類型(包括肝細胞、膽管細胞、內皮細胞和星狀細胞群)的人肝臟類器官，且該類器官在能量儲存、化學物質轉運、脂肪積累、酶的活性及蛋白質產生方面與成年人體肝臟功能較為接近，但研究人員指出該方法形成的類器官并不能反映肝功能的所有特性，如CYP2C19活性和尿素合成。

1.2 成纖維細胞轉分化形成的肝臟類器官

轉分化是由一種已分化的細胞類型轉化為另一種已分化細胞類型的過程，通過此技術誘導形成的細胞一般具有較為成熟的狀態和特定個體的功能，其方法主要包括生長因子誘導、抑制劑處理、轉錄因子誘導等。已有研究證實可利用小鼠成纖維細胞成功轉化為其他類型細胞，而人們普遍認為人類細胞對譜系重新編程具有抗性[32]。2011年Wernig實驗室首次利用與誘導小鼠神經細胞不同的轉錄因子共同作用于人的胚胎成纖維細胞和新生兒成纖維細胞，經過轉分化技術成功獲得了人的神經細胞(iN細胞)，但其效率較低，且iN細胞的跨膜電位突觸響應能力和去極化水平均較弱，表明形成的神經細胞并不屬于成熟神經細胞[33]。2014年惠利健團隊[34]采用過表達FOXA3、HNFlA和HNF4A 3種轉錄因子能在14 d內誘導人成纖維細胞(早期)轉分化為穩定的無增殖能力的肝實質細胞類似細胞(hiHep細胞)，并利用過表達SV40 large T antige的HFFl細胞可獲得增殖性hiHepLT細胞，獲得的細胞不僅具有和肝實質細胞相似的基因表達譜，還具有分泌血清白蛋白、積累肝糖原、代謝異源物質等肝細胞功能(肝細胞功能鑒定標準見表1)，且將其植入肝損傷小鼠肝臟后發現，該細胞不僅可整合至小鼠肝臟內，還能達到治療肝損傷的功效，首次證實了轉分化形成的細胞可在體內發揮功能。

表1 肝細胞功能的鑒定方法[35]Table 1 Identification criteria of liver cell quality

1.3 腫瘤組織來源的類器官

新鮮分離或組織保存液保存的原代肝組織可用于培養人肝臟類器官，培養的主要方法是通過篩選肝組織中的LGR5+細胞，然后在主要含有R-spondin、內皮細胞生長因子、肝細胞生長因子、煙酰胺和成纖維生長因子10的肝臟類器官培養基中進行培養[36]。隨著研究的不斷更新，通過加入CAMP信號通路激動劑FSK和TGFβ受體抑制劑A8301對培養基進行改良后，可提高肝癌類器官的擴增效率[37]。自2017年日本Takahiro Ochiya團隊通過向培養中添加TGFβ抑制劑、GSK3抑制劑和ROCK抑制劑的方法，將小鼠成熟肝實質細胞成功去分化形成能在體外長期培養的肝前體細胞后，鄢和新團隊[38]于2018年通過人肝實質細胞去分化形成了在體外擴增的肝臟干細胞，實現了原代肝細胞的擴增和逆轉，成為肝病研制新細胞源。同年，惠利健團隊通過對培養條件優化，利用去除培養基中的Rspo1、Noggin和 forskolin成分，并加入Wnt3a等因子的方法，于2D培養技術下實現肝細胞擴增，再利用3D培養技術經誘導再分化成功構建出具有成熟肝細胞功能的肝細胞，且在體外能擴增至3～4代，在5% O2條件下可擴增至少8代，同時將其轉移至肝衰竭小鼠體內發現，擴增的肝細胞與原代肝實質細胞具有類似的治療肝衰竭小鼠的作用，其中超過70%小鼠存活，而設置的對照組小鼠全部死亡[39]。

2018年Hans Clevers團隊通過將組織消化的時間由1 h延長至2～5 h或12 h，結果達到了降低非腫瘤細胞數量的目的，并通過改變組織的起始培養條件，使用去除了經典培養基[37]中的R-spondin-1、Noggin和Wnt3a，添加了地塞米松和Rhokinase抑制劑后，成功構建了8例不同原發性肝癌(primary liver cancer，PLC)患者的人PLC衍生類器官。經檢測后發現，PLC衍生類器官不僅具有原組織結構和基因表達，且在相同的培養條件下不同的腫瘤組織和亞型亦能長期在體外擴增培養。同時，移植實驗結果表明PLC衍生的類器官在體內具有致瘤性，并保留了其組織學特征和轉移特性，可用于生物標志物鑒定和藥物篩選試驗[40]。2019年Liang等[41]研究發現人源肝癌類器官在同種培養基中長期培養后，可用于區分不同腫瘤組織及亞型，且能保留源組織的組織結構、基因圖譜等。研究發現，原代組織來源的肝臟類器官與干細胞分化和成纖維細胞轉分化誘導形成的類器官相比，在體外長期培養過程中拷貝數或其他基因組結構的變異機率較低，能夠更好地反應和穩定維持原樣本的遺傳特性，在類器官的培養中可能更有優勢[36]。

2 肝癌類器官的應用研究

2.1 肝臟相關疾病模型的構建

類器官可用于研究疾病的穩態、發展和作用機制，能夠在疾病的診斷、治療方面提供新方法。目前，已成功構建了不同種類肝臟疾病模型，為肝臟類疾病發生的分子機制和治療方法提供了有效的研究平臺。

iPSC來源的肝臟類器官可用于模擬 Alagille綜合癥(alagille syndrome，ALGS)、囊腫性纖維化(cystic fibrosis，CF)和傳染性疾病三種肝臟疾病類型[42-46]。Alagille綜合癥是一種常染色體顯性多系統疾病，伴有JAG1或NOTCH2突變，其主要特征之一是膽管異常引起的肝損傷[3,47-48]。CF是由囊性纖維化跨膜電導調節因子基因突變引起的疾病，可引發肝臟內的小膽管堵塞。2015年Lorent等[42]采用bioliatresone作用于鼠膽管細胞類器官后，發現類器官出現管腔變窄、細胞結構被破壞等現象，證實bioliatresone可導致膽道閉鎖，同時該類器官可用于構建膽道閉鎖先天性肝臟類疾病模型。iPSC誘導后分化為膽管細胞，置于3D培養條件下，可形成具有膽管標志物表達和體內相似的膽管功能的膽管類器官，與實驗對照組相比，ALGS患者的iPSC形成的類器官具有肝臟受損后的自我組裝和再生能力[43]。從CF患者的iPSCs中產生的類器官具有CF的典型特征，如CFTR蛋白錯折疊、氯離子通道和膽管細胞功能障礙[26-27，44]。Baktash等[45]利用HCV感染肝癌類器官，構建出的HCV疾病模型不僅可表達HCV定位相關因子，且可對其作用機制進行研究。此外可利用重編程技術，將不同類型疾病相關基因的突變導入至正常類器官中，為腫瘤病因及發病機理研究提供良好的人源腫瘤類器官模型[46]。

體外培養人原代肝細胞形成的類器官與體內肝臟的疾病狀態最為相似[49]。以α1-抗胰蛋白酶缺乏癥(alphal-antitrypsin deficiency, AATD)為例，該遺傳性疾病的特征是ALAT蛋白折疊異常。研究發現，從AATD患者原代人肝細胞形成的肝臟類器官可以模擬體內肝臟病理狀態，形成的類器官表現出ALAT蛋白聚集和內質網應激、細胞凋亡數增加等現象[37,50]。此外，從原代人肝細胞形成的肝臟類器官也可用于高血糖、非酒精性脂肪肝等體外代謝紊亂研究，如Ouchi等[51]將培養形成的肝臟類器官置于游離脂肪酸中，發現脂質物質在類器官中存在堆積現象，且隨著培養環境中脂質含量的增加,類器官脂肪變性程度不斷加重，表現出纖維化和炎癥反應等表型，證實該類器官可作為脂肪變性相關的代謝性疾病模型。

2.2 肝癌類器官在藥物研發中的應用

在藥物篩選和開發過程中，傳統臨床前試驗主要采用細胞系培養和人源性腫瘤異種移植物(PDX)模型，其中藥物研發主要依賴永生化細胞系用于高通量篩選。但肝細胞是具有高度細胞極性和異質性的細胞，其細胞極性主要表現在肝細胞功能和形態等方面，而大多數2D培養的肝細胞在培養2～3天內便失去細胞極性，導致在2D培養的細胞系模型上無法得到準確真實的實驗結果。另外，細胞系在人體對藥物的反應性和耐受性等方面均具有顯著差異，大部分藥物即使在前期通過了臨床前試驗，當其進入人體試驗時仍以失敗而告終[52-54]；人源性腫瘤異種移植物(PDX)模型雖然能夠模擬原代腫瘤基因組結構、組織病理學及藥敏反應，但由于異種差異使其基因的表達圖譜與原發灶腫瘤區別較大，腫瘤異位移植中導致腫瘤形成部位不同，同時存在建模周期長和成功率低等問題[55]。因此迫切需要能重現原發患者腫瘤生理病理且可穩定擴增的體外模型用于臨床前藥物開發。

肝癌類器官技術可從不同發病階段的肝癌患者手術或活檢組織中分離原代細胞，體外三維培養快速形成類器官。肝癌類器官不僅能重現原組織結構和其突變特征，而且能在體外長期培養時保持原組織的遺傳穩定性，成為現有藥物篩選模型的有益補充。因此，肝臟腫瘤類器官成為臨床前藥物篩選的有效模型。2017年Broutier等[40]揭示，不同類型的原發性肝癌的基因突變譜對于不同治療藥物的敏感性不同，如CTNNB1突變的肝細胞癌類器官對LGK974耐受，而膽管癌類器官對其較為敏感。據已有研究報告表明，通過利用植物性多空水凝膠制造形成的合成型3D支架生長細胞，其尺寸僅為100 μm，可輕松將其用于96孔板中進行高通量藥物篩選和檢測，該方法可產生數十至數百個特殊支架，并可將其與原始肝臟腫瘤的異質性和遺傳特性結合用于肝癌藥物的研發[56]。在一項藥物研發實驗中，研究者利用收集的2 300種藥物制劑作為SPECTRUM藥物文庫處理來源于PSC的肝臟類器官時，結果篩選出能夠降低肝臟細胞中ApoB水平的9種強心苷制劑，可用于降低家族性高膽固醇血癥患者體內低蛋白膽固醇水平和心力衰竭的治療，該研究成果有效推動了他汀類藥物替代制劑的研發[29]。

2.3 肝臟類器官在器官移植中的應用

目前肝臟類器官在小鼠模型上實現的細胞移植應用研究，顯示出一定的治療效果。如Takebe等[25]研究人員通過細胞共培養的方式獲得iPSC來源的類器官后，將其植入急性肝損傷的小鼠體內后，發現形成的類器官可在小鼠肝臟內迅速填充，并且小鼠的存活時間和存活率均提高。同時，將肝臟類器官植入Ⅰ型酪氨酸血癥小鼠體內后，肝臟類器官亦可迅速增殖并在小鼠肝臟受損部位具有顯著的填充效果[57]。另有研究發現，將肝外膽管類器官植入到不同的生物支架上，可獲得相似的肝外膽管、膽囊壁的生物工程組織，并可成功修復膽囊受損小鼠膽囊壁及其膽外管損傷[58]。

此外，有研究發現通過CRISPR技術將來自于人源干細胞的肝組織轉化為肝臟類器官后，將其移植入具有肝損傷的小鼠體內，發現經移植后在動物血液中能夠檢測到人白蛋白，并可延長小鼠壽命[31]。

3 展望

肝臟類器官在體外保留了源組織的組織學特性和基因表達特征，同時與源組織高度相似的特性使其成為細胞系及動物模型的有益補充。肝臟類器官的構建不僅解決了肝臟腫瘤研究領域中肝實質細胞無法在體外長期培養和擴增的障礙，其在疾病模型構建、藥物研發和細胞移植等方面均具有良好的應用前景。特別是對于肝癌這類具有強異質性的疾病，肝癌類器官未來有望實現針對個人的精準化醫療檢測、取代試驗動物進行藥物毒理測試，并向著體外培養可用于臨床、可移植、可改造器官的目標不斷前行。

然而，目前肝臟類器官在培養體系上仍存在成功率較低、培養成本高昂、組織細胞類型尚未健全、部分功能尚未具備等問題。例如缺少肝臟獨特的免疫特征，包括高密度的免疫細胞浸潤、較強的免疫原性和多種免疫微環境等。目前還無法在肝臟類器官模型中探究免疫藥物在患者中的作用。未來通過技術的不斷發展，實現肝臟類器官與神經、血管、間質細胞及免疫細胞等多種細胞的體外三維共培養，有可能利用肝臟類器官模型探究其與各組織間的相互作用，實現肝臟類器官技術在藥物開發、疾病模型及個性化治療領域更為廣泛的應用與臨床轉化。