Nrf2/HO-1信號通路在男性不育癥中的研究進展*

丁豪帥 綜述，張 斌，常德輝△ 審校

(1.甘肅中醫藥大學臨床醫學院，蘭州 730000；2.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院泌尿外科，蘭州 730050)

氧化應激是指機體組織和細胞內活性氧(ROS)自由基產生過多積聚或抗氧化劑對其清除發生障礙，導致氧化還原系統失衡，引起細胞內核酸損傷、脂質過氧化和蛋白質損傷，致使能量代謝異常，誘發細胞凋亡乃至組織器官功能障礙[1]。為了維持氧化還原反應平衡，生物體內形成了較為完整的抗氧化防御系統。核因子E2相關因子2(Nrf2)是一個關鍵的轉錄因子，血紅素加氧酶(HO)-1是受Nrf2調控的一個重要的抗氧化酶，它是一種Ⅱ相解毒酶，也是血紅素在分解代謝過程中的限速酶，可將血紅素分解為一氧化碳、游離鐵和膽綠素[2]。近年來研究發現，HO-1為一種機體內源性抗氧化劑和細胞保護酶，它在多系統氧化應激相關疾病中發揮著重要的調節作用。本文就Nrf2/HO-1信號通路在男性不育癥中的研究進展綜述如下。

1 Nrf2/HO-1概述

Nrf2由7個功能性Neh結構域(Neh1～7)組成，其中氨基末端Neh2結構域對Kelch樣ECH相關蛋白1(Keap1)起著調控作用，Keap1是一種氧化應激傳感器[3]。在生理條件下Nrf2與Keap1結合于細胞質中,負責Nrf2的細胞質隔離。在ROS及某些親電子基團誘導的氧化應激條件下，Nrf2和Keap1之間的構象聯系發生變化，Nrf2與Keap1解離后進入細胞核內，Nrf2的Neh1結構域與Maf蛋白耦聯形成異二聚體后，與抗氧化反應元件(ARE)結合[4]，誘導啟動下游多個抗氧化酶系的表達，如：HO-1、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)和醌氧化還原酶-1(NQO1)等，上述蛋白分子參與了拮抗由ROS誘導的氧化應激反應的過程，保護機體免受毒性物質的傷害[5]。

HO是Nrf2調控的Ⅱ相解毒酶之一，有可誘導型HO-1、結構型HO-2及含量甚微尚未明確的HO-3 3種同工酶。研究表明，HO-1及其代謝產物一氧化碳、游離鐵和膽綠素在抗氧化過程中發揮著重要作用[6]。Keap1-Nrf2/ARE信號途徑的激活，與多種促氧化劑和炎性疾病等因素的刺激有關，這使得Nrf2和HO-1的表達上調，清除過量的ROS，以減輕組織細胞內的氧化應激水平，使內環境氧化還原處于動態平衡[7]。完整的Nrf2/HO-1信號通路通過抗炎、抗氧化、減輕線粒體損傷、調控細胞凋亡、自噬等多種機制，最終影響氧化應激性疾病的轉歸。

2 Nrf2/HO-1信號通路的作用機制

2.1 抗炎及抗氧化

研究發現，應用抗腫瘤藥物多柔比星引起急性或慢性劑量相關性的心肌毒性不良反應，這與藥物代謝過程中ROS的產生并誘發細胞內線粒體與核酸氧化損傷、炎性反應、心肌纖維變性等多因素有關[8]。在病變心肌細胞中發現的Nrf2缺失使得氧化程度加重，進一步加劇了心肌病理改變，而早期通過增加Nrf2的誘導進行干預則顯示出可減輕這種心肌毒性的損傷。在百里醌改善大鼠肺纖維化炎性反應過程中，Nrf2/HO-1通路起著積極的作用[9]，通過靶向誘導HO-1等抗氧化酶的表達水平，肺組織中促纖維化細胞因子的生成受到了抑制。同時炎性因子釋放的減少減輕了氧化應激帶來的損傷，從而起到了保護肺功能的作用并延緩了肺纖維化的進展。在小鼠發生膿毒癥相關性腦病的早期腦組織標本內可檢測到高水平的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)等促炎介質[10]，它們介導了神經中樞炎性因子的釋放，引起神經元細胞水腫、結構損傷，導致神經系統功能紊亂。而Nrf2的激活及下游保護性蛋白的檢出被證實在氫氣預處理用于改善此類小鼠腦損傷的治療中能夠有效抑制炎性因子釋放，減輕局部微血管內皮通透性，進而改善了膿毒癥引起的腦組織病理性氧化損害。

有學者將HO-1基因敲除模型的小鼠與野生型小鼠置于缺氧、細胞毒素處理的應激環境后，檢測到小鼠組織細胞內ROS明顯升高，野生型小鼠通過激活Nrf2途徑及HO-1表達的上調，降低ROS水平來拮抗自由基的氧化損傷，起到保護臟器結構功能的效應[11-12]。而在HO-1基因敲除小鼠中發現，由于HO-1的缺乏使得細胞抵御氧化損傷的能力低下，ROS清除障礙而導致其更易出現多臟器功能衰竭且預后不良。以上研究均提示了Nrf2/HO-1信號通路具有抗炎與抗氧化的能力，對心肺腦等重要臟器具有保護作用。

2.2 維持線粒體的穩定

線粒體是細胞質內進行物質能量代謝的重要細胞器，ROS是代謝循環中經呼吸鏈產生的一種副產物，脂滴的形成是細胞受到應激后的重要標志之一。LEE等[13]通過對高氧、缺氧、心肌缺血、敗血癥的小鼠模型進行了相關研究，證實了上述應激源環境均可破壞線粒體DNA結構與功能的完整性，主要表現為嚴重的線粒體腫脹和三磷酸腺苷(ATP)能量供應缺乏，線粒體代謝功能發生紊亂可誘導脂滴的形成，這在一定程度上加劇了原有的氧化損傷。YU等[14]發現，細胞在響應內外源性有害因子時，線粒體的生物發生與功能隨之出現異常，然而在激活Nrf2后，再次觀察應激所導致的線粒體形態與功能障礙得到明顯改善，提示了這可能與Nrf2調控相關抗氧化酶的表達，清除線粒體內過多的ROS，從而減輕自身損傷有關。線粒體膜電位水平及通透性的改變也是引起細胞能量代謝異常的重要因素之一，研究發現細胞在受到氧化因素刺激時由于ROS的過多蓄積，使得線粒體膜電位生理屏障遭到破壞，通過進一步對細胞內ATP水平進行評估，證實了HO-1表達水平的提高對于氧化應激狀態下線粒體功能完整性的維持起到保護作用，以此來減輕細胞結構與功能的受損[15]。以上研究證實了Nrf2的激活可誘導下游抗氧化基因的表達來調節細胞內ROS的平衡，有助于穩定線粒體膜電位水平，促進脂肪酸氧化、氧化磷酸化和線粒體的生物合成有序進行，重要的是減輕了線粒體的氧化損傷。基于這種發現，應用Nrf2及HO-1的激活劑是否可以作為相關疾病的防治策略，值得更深入思考。

2.3 調控細胞凋亡

細胞凋亡表現為細胞膜完整、染色質斷裂與凝集、細胞核皺縮及凋亡小體形成等形態學改變。調控凋亡的基因主要是半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族，Caspase級聯反應可被細胞內信號(如，應激)和細胞外信號(如，細胞表面死亡受體及其配體)所啟動[16]。因此，凋亡是氧化應激狀態下常出現的一種細胞死亡方式。以往研究表明，Nrf2在調控細胞凋亡方面是一把“雙刃劍”[17]：(1)在正常細胞內,Nrf2利用其通路特性來抵御氧化損傷、促進細胞適應性修復并防止失控性生長而發揮抗炎、抗腫瘤等作用；(2)Nrf2在惡性腫瘤細胞內又能起到抗凋亡、促進細胞增殖及對化療藥物產生耐藥性等不利作用。SUN等[18]發現龍生蛭膠囊在用于大鼠缺血性腦卒中的治療方面具有減輕神經元細胞損傷、改善中樞功能恢復等作用，通過給予藥物預處理后，大鼠腦組織Nrf2、HO-1、SOD、CAT等保護性蛋白上調顯著，脂質過氧化標志物丙二醛(MDA)水平明顯降低，同時測得凋亡標志物Caspase-3及Bcl-2相關X蛋白(BAX)的水平較前下降，抗凋亡蛋白Bcl-2基因的表達活性增加，凋亡神經元細胞的數量亦呈現減少，這表明了Nrf2/HO-1通路的激活具有抵御細胞氧化損傷及抗凋亡的作用。另有研究指出，Nrf2在結直腸癌癌細胞中可抑制細胞的凋亡，而這種特點在一定程度上增加了結直腸癌對抗腫瘤藥物奧沙利鉑產生耐藥性，導致腫瘤細胞更易增殖擴散并因此增加了腫瘤發生遠處轉移的可能性，這為抗腫瘤藥物的臨床治療帶來了新的困難與挑戰，同時也為學者提示了一種新的研究思路與方向[19]。基于Nrf2在調控細胞凋亡過程中的作用及如何將這一潛在治療靶點加以利用，仍需進一步的討論。

2.4 調控自噬-溶酶體系統

自噬主要利用溶酶體降解自身受損的細胞器等細胞質內大分子來調控內環境穩態。p62是介于自噬與Keap1/Nrf2信號通路之間的關鍵接頭蛋白，在細胞質內p62可與Nrf2競爭性地結合Keap1形成復合物，借助其與Keap1的復合體形式通過自噬-溶酶體途徑將Keap1攜至自噬體中進行隔離降解，該過程中因Keap1與Nrf2的結合狀態受到p62的干擾，Nrf2與Keap1解離后轉移至細胞核內并激活下游靶基因的轉錄過程[20]。研究發現，p62也是Nrf2的調節靶標之一，氧化應激發生后，Nrf2進入細胞核內可與p62啟動子上的ARE序列識別結合，p62表達亦出現上調，以上反映出Nrf2與p62之間具有正反饋的調節環路[21]。二者之間的分子作用機制還需進一步探討，這為后續通過Nrf2調控自噬環節來探索相關疾病防治的策略提供了理論支持和導向。

3 抗氧化信號通路在男性不育癥中的研究

3.1 各種抗氧化基因

男性生殖系統在生理情況下存在少量的ROS，這對于精子的發生與正常功能的調節(如：精子獲能、頂體反應及精卵結合)必不可少[22]，但在一些內外源性理化因素(如：環境污染、電離輻射、毒素、缺氧、精索靜脈曲張、高脂飲食、久坐不動)等作用下，ROS異常增多可使氧化還原系統的平衡被打破而誘發氧化應激的發生，由于精子質膜和細胞質中含有大量的不飽和脂肪酸，因此精子容易受到ROS的攻擊[23]。研究發現，男性生殖道中的抗氧化基因酶系主要包括SOD、HO-1、CAT、GSH-Px、谷胱甘肽S-轉移酶(GST)和一氧化氮合酶(NOS)等，它們在精子的發生和維持正常精子生理功能中起著重要的調節作用[24]。而Nrf2是內源性抗氧化信號通路中最重要的轉錄因子之一，Nrf2表達的缺失，可導致一系列抗氧化基因酶系激活障礙，使ROS對精子的病理損害加劇，構成了男性不育癥發生的重要原因。

3.2 體內和體外實驗

JIANG等[25]研究表明，白藜蘆醇能夠保護大鼠精母細胞免受脂質過氧化作用，減少生殖細胞的凋亡，促進精子的產生和運動能力的增加，并保護其免受毒素的侵害，其機制被證實與激活Nrf2及其下游抗氧化基因的轉錄有關。研究發現，駱駝乳清蛋白能降低小鼠睪丸組織熱應激損傷后的ROS水平，恢復Nrf2、SOD、GSH-Px、CAT的表達活性，而Bcl-2的下調提示抗氧化基因可能通過降低精子凋亡率來保護睪丸功能并提高生育能力[26]。JIN等[27]發現，當歸提取物中的紫花前胡素在實驗大鼠單側隱睪癥中主要是通過Nrf2介導的HO-1上調來維持SOD的活性水平，進而減輕精子受到的氧化應激并可提高精子數量與活力，改善隱睪引起的不育癥。NAKAMURA等[28]通過對野生型和Nrf2基因敲除模型的小鼠進行研究，發現Nrf2缺失的小鼠曲細精管結構常發生萎縮變性，睪丸及附睪內的精子數量和精子運動能力下降明顯，生殖細胞凋亡的水平增高、HO-1等抗氧化酶水平低下，提供了氧化應激對睪丸和附睪具有不利影響的相關證據，提示了轉錄因子Nrf2在防止精子發生氧化損傷中具有關鍵的作用，抗氧化酶的上調能有效降低睪丸與附睪中的氧化應激水平，表明Nrf2可被考慮作為一種預測ROS相關男性不育癥的生物標志物。以上關于體內和體外實驗的結果，為激活Nrf2抗氧化通路可以防御氧化應激損傷這一理論提供了進一步的支持。

3.3 Nrf2與男性不育

臨床調查中，約15%的育齡夫婦被不育問題所困擾，其中，由于男性原因引起的不育癥約占50%，這已成為影響人類健康的一個社會問題[29]。隨著生殖醫學研究的深入，氧化應激已被公認為是引起男性不育癥的重要因素之一，近年來成為一項關注的熱點。高水平的脂質過氧化反應作為氧化應激的標志之一，同時也是造成精子結構破壞、DNA損傷斷裂和異常凋亡的重要環節，由此帶來的精子產生與成熟障礙、活動度與受精能力低下等影響均可導致男性不育癥的發生[30]。

研究發現，不育癥男性的精漿較可育男性組存在明顯高水平的ROS及低水平的抗氧化酶表達[31]。與此同時，精子DNA碎片化指數的增高證實了氧化應激與精子DNA損傷之間存在一定的關聯性，因此，相關氧化物質及抗氧化基因酶系的水平可被考慮作為評估精子質量并預測生育能力的有效指標。CHEN等[32]研究發現，與正常男性對照組相比，少精、弱精癥患者精液中Nrf2 mRNA的表達量普遍缺乏，SOD、CAT的活性低下，測得精子濃度、向前運動精子百分率、存活率等指標明顯低于對照組，這提示經Nrf2轉錄的抗氧化酶在清除ROS對精子的氧化損傷方面具有重要的地位，Nrf2表達的水平與精液分析相關參數指標存在正相關性。BARIK等[33]開展的一項基于男性不育癥人群應用抗氧化劑的干預性研究顯示，受試者在進行90 d的抗氧化治療后，復查精漿總抗氧化劑水平明顯增加，ROS水平趨于降低，MDA水平較干預前顯著下調，精子形態、數量、運動能力等指標均得到一定程度的改善。該研究結果表明了ROS必須控制在適當的水平以維持精子正常的生理功能，同時還應避免過高而對精子產生的病理性損害。

3.4 抗氧化劑在男性不育癥中的應用

近年來，隨著男性不育癥防治研究的開展，抗氧化治療措施引起了人們的關注。研究發現使用姜黃素能夠提升弱精癥男性精液中Nrf2的表達，并降低原有高水平的ROS，提高精子活力來發揮抗氧化作用，而在給予鴉膽子苦醇(一種 Nrf2的抑制劑)后，Nrf2蛋白水平降低，精子運動能力明顯低于姜黃素組[34]。有學者發現補充維生素C可使睪丸中Nrf2表達增加、精子細胞畸形率與凋亡率得到減少，起到改善精子質量的療效，據此推測維生素C作為一種眾所周知的清除自由基的抗氧化劑，它在提高男性生育能力方面可能具有一定的作用[35]。研究表明硫辛酸可通過改善線粒體的能量代謝過程來減少ROS生成，進而減輕睪丸與附睪的氧化損傷，為精子的產生與成熟提供良好適宜的微環境，可作為治療少弱精子癥的有效選擇[36]。基于以往研究，抗氧化劑可以減少男性生殖系統ROS的蓄積，通過靶向激活Nrf2/HO-1信號通路的抗氧化治療，未來可能成為提高精子質量、治療男性不育癥的有效路徑。

4 展 望

男性不育癥是臨床工作中的一類常見病，發病機制涉及炎性因子、線粒體損傷、細胞凋亡、自噬等方面，并與多種抗氧化蛋白分子之間存在復雜的聯系。男性生育能力的低下與生殖系統中氧化損傷的增加和抗氧化能力的下降有關，雖然現有大多數證據強調了Nrf2/HO-1信號通路獨特的抗氧化活性，一些相關靶向抗氧化劑亦逐步用于治療男性不育癥，但目前具體的實施策略尚缺乏明確的共識，這可能是由于不同抗氧化劑的組合方式、適宜濃度劑量、給藥周期及有效性指標監測等方面存在較大個體差異。

因此，在未來的研究中，研究者需要在細胞和動物模型中開展分子水平更深入廣泛的研究，并注意Nrf2/HO-1抗氧化信號通路中各蛋白分子表達與精液分析等指標的關系，對于指導抗氧化藥物的開發應用與推廣，以及男性不育癥的臨床預防和治療仍是必要的。