肺癌相關成纖維細胞的異質性及研究進展*

謝志丹，梁亞奇 綜述，徐芹芹 審校

(1.青海大學，西寧 810016；2.青海省人民醫院腫瘤內科，西寧 810007)

肺癌是全球發病率和病死率位居第一位的癌癥，其治療依賴于病理診斷及分子病理診斷。肺癌根據組織學特征可分為非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌(SCLC)兩種類型，NSCLC又主要分為腺癌和鱗癌，腺癌中最常見的驅動基因是表皮生長因子受體(EGFR)、間變性淋巴瘤激酶(ALK)、c-ros原癌基因1酪氨酸激酶(ROS1)等基因。對于沒有驅動基因突變的肺癌，標準治療方案以鉑二聯為基礎聯合抗血管生成或免疫檢查點抑制劑。對于存在驅動基因突變的肺癌，標準治療方案為小分子酪氨酸激酶抑制劑，耐藥后根據相應的分子病理特征選擇后續治療方案；但是無論靶向治療、化療，還是化療聯合免疫治療，耐藥機制一直是困擾臨床診治的難題。近期有研究發現腫瘤微環境(tumor microenvironment，TME)是影響臨床治療效果的重要因素[1]，闡明TME的成分及其腫瘤調控機制將有助于解決肺癌治療耐藥這一重大難題。

TME是由細胞外基質細胞、多種細胞成分、細胞因子、生長因子、趨化因子等構成，其成分通過多種方式與腫瘤細胞相互依存、相互作用，參與腫瘤的發生、發展和轉移[2]。癌相關成纖維細胞(carcinoma-associated fibroblasts，CAFs)是構成TME的主要細胞成分之一，也是促進腫瘤發生和發展的主要基質細胞成分。以往系列研究闡明了CAFs的細胞特征，證明了其具有促進腫瘤的血管新生、腫瘤浸潤和侵襲、腫瘤上皮間質轉化等作用[3]。并開始嘗試研究靶向CAFs對腫瘤治療效果的影響。近年來多組學技術的發展，尤其單細胞轉錄組學、細胞代謝和重編程等領域的進展，使醫學界對CAFs異質性、代謝紊亂及炎癥調節等新機制有了更深入的認識。隨著對外泌體、細胞融合及線粒體轉運機制的闡明，醫學界對CAFs與腫瘤細胞的相互作用也有了全新的認識，顛覆著靶向肺癌治療的方向。本文主要就近年來CAFs異質性及靶向TME治療的進展作一概述。

1 多組學技術揭示CAFs異質性本質

CAFs已經從多種腫瘤如腦腫瘤、腎腫瘤、卵巢腫瘤及消化道腫瘤和肺癌等組織中分離出來。以往眾多研究闡明了CAFs的細胞特征，如特異性表達α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、成纖維細胞激活蛋白(fibroblast activation protein，FAP)、血小板源性生長因子受體-β(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR-β)、成纖維細胞特異性蛋白-1(fibroblast specific protein-1，FSP-1)等標志物。CAFs生物學特性研究表明，其通過直接或間接機制調控腫瘤耐藥、侵襲轉移、血管生成、上皮間質轉化及代謝紊亂等[4-6]。在動物實驗中，臨床腫瘤標本分離的CAFs與癌細胞混合后植入裸鼠皮下，可明顯加速腫瘤形成[5]。CAFs促進腫瘤生長的可能機制還包括旁分泌及趨化內皮祖細胞和單核細胞等。

CAFs代表一類異質性非常強和多來源性細胞，被描述為紡錘樣細胞并不表達上皮、內皮及白細胞表型的一類細胞。CAFs來源可能由腫瘤基質中正常成纖維細胞(normal fibroblasts，NFs)分化而來，也可能是在腫瘤細胞刺激下重編程所致[7]。闡明CAFs的異質性及激活機制是其靶向治療的關鍵。以往研究只是從細胞表型和功能特點闡述了CAFs的異質性。近年來隨著單細胞轉錄組學及空間轉錄組學等新技術的發展，從基因層面更明確了CAFs轉錄特征，結合細胞代謝及重編程特點，從全新角度了解CAFs的異質性及功能差別。

利用多組學技術，包括單細胞轉錄組學、基因組學、表觀遺傳性學、蛋白質組學等數據的整合，有效闡明了TME中CAFs的細胞類型和功能，并為靶向CAFs治療提供了基礎[8]。在肺癌單細胞轉錄組學研究中，腫瘤CAFs存在眾多不同的細胞亞群，部分CAFs具有類似纖維母細胞特性，部分亞群則更加類似前血管細胞的特征，有些則高表達細胞生長因子和免疫調節分子，從而在形態特征、空間關系、功能特征及細胞外基質方面闡明CAFs的異質性。為針對性靶向CAFs細胞亞群干預腫瘤提供了理論基礎。LAMBRECHTS等[9]分析了5例肺腺癌或鱗狀上皮癌患者腫瘤標本的52 698個細胞單細胞轉錄序列，鑒定出了52種CAFs，在這52種CAFs亞型中，盡管都歸類為纖維母細胞，但在表達譜、代謝特征和細胞表征方面體現出巨大的差別，有的克隆非常類似成纖維細胞，有的克隆具有非常強的上皮間質轉化特性，能分泌眾多的細胞外基質蛋白，部分克隆高表達平滑肌動蛋白α2(ACTA2)和高分泌轉化生長因子β(TGF-β)。對來自患者的肺癌、結直腸癌、卵巢癌和乳腺癌等多種腫瘤基質細胞異質性進行單細胞RNA和蛋白質組分析，確定了共同特征的68個基質細胞亞群，每個亞群在標記基因、轉錄因子、代謝活動和組織表達均存在差異。其中，46個亞群是所有癌癥共有的，其余22個亞群是每種腫瘤特異性的[10]。利用整合的單細胞表達譜及多組學分析還能夠確定肺癌內皮細胞的異質性及調節血管生成的候選基因。單細胞轉錄組還闡明腫瘤中內皮細胞異質性，發現了以前未被認識的內皮細胞表型,包括參與調節免疫監視功能[11]。對腫瘤基質細胞的精細分類和細胞間空間關聯注釋，將提高對TME異質性的理解，并有助于針對不同亞群研發靶向腫瘤治療的策略[12]。

2 腫瘤CAFs激活及其代謝異常的機制

CAFs激活的原因和機制是探索其干預措施的基礎。癌細胞對鄰近CAFs的活化作用主要通過外分泌的細胞因子，包括TGF-β、肝細胞生長因子(HGF)[13]、血小板衍生生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、胰島素樣生長因子(IGF)[13-15]均已被證明對CAFs具有活化作用，其機制與核因子-κB(NF-κB)、TGF-β/Smad、Janus蛋白酪氨酸激酶/信號轉導子及轉錄激活因子-3(JAK/STAT3)等通路有關。癌細胞還可以通過趨化和刺激腫瘤相關巨噬細胞等分泌炎性介質，如白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和IL-6等進而間接活化CAFs。此外，TME的缺氧狀態亦可通過激活G蛋白偶聯受體信號誘導CAFs的活化[16]。

CAFs活化是導致TME代謝異常和炎癥環境的重要因素。大量的單細胞轉錄組學分析表明NSCLC的高葡萄糖吸收與增殖和侵襲特性密切相關。在TGF-β及其他信號刺激下，NFs向CAFs的轉化過程中會誘導谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉氨酶2(GFPT2)表達并導致CAFs的糖代謝異常，從而改變糖酵解、磷酸戊糖途徑、檸檬酸循環途徑[17]。因此，GFPT2及其他關鍵酶也成為腫瘤組織CAFs的標志，并可能發展為潛在的肺腺癌治療靶標[18]。CAFs的異常代謝產物可能影響腫瘤細胞進行重編程和自噬，成為區別NFs的重要特征[18]。

3 CAFs調節肺癌細胞生物學特性的機制

3.1 CAFs提供炎性TME

CAFs炎性信號通路激活并分泌各種炎性因子，使TME呈現炎性狀態。肺癌CAFs中環氧化酶-2(COX2)和前列腺素E2(PGE2)-整合素信號軸過度激活，從而促進腫瘤的發展。靶向抑制COX2可有效減少細胞因子的分泌并減低鱗狀細胞癌惡化[19]。大數據發掘發現，COL1A1與NSCLC復發有關聯。總體而言，炎性環境是CAFs和鱗狀細胞癌相互作用紊亂的基礎。靶向COX2和SRC激酶可能是一個有效預防肺癌進展的策略[19]。

3.2 外泌體微RNA(miRNA)和長鏈非編碼RNA(lncRNA)

CAFs除了分泌細胞因子、趨化因子等機制調節腫瘤細胞外，還通過外泌體放射調控肺癌細胞生物學特性。細胞外泌體是包含了復雜RNA和蛋白質的小膜泡，直徑在40～100 nm。CAFs釋放外泌體是CAFs調控腫瘤細胞特征的重要方式。miRNA是外泌體中的主要成分之一，也是外泌體發揮生物學作用的主要機制。如miR-210在轉移肺癌細胞外泌體中是促血管新生的因素，通過調節Janus蛋白酪氨酸激酶2(JAK2)/STAT3通路影響腫瘤細胞的生物學特性[20]。腫瘤來源的外泌體miR-1247-3p誘發CAFs激活促進肝癌肺轉移[21]。除了分泌促血管生長因子之外，CAFs分泌的外泌體也參與轉移灶的TME形成。另外，外泌體中CAFs相關分子也可能成為診斷的靶標，如血液中整合素β1微粒可以預測腫瘤轉移[22]。CAFs外泌體已經成為腫瘤診斷的標志物和腫瘤治療的靶分子。因此，針對CAFs的干涉策略對防止腫瘤細胞轉移很有意義。

3.3 CAFs的生物活性物質傳遞

CAFs合成生物大分子介導了CAFs對腫瘤細胞的調控。中期因子(midkine)是一個肝素結合生長因子，介導CAFs誘導腫瘤細胞的耐藥性。CAFs高表達midkine抑制順鉑誘導的細胞凋亡，可能是腫瘤順鉑耐藥性機制之一[23]。腎小球足細胞膜黏蛋白(podoplanin)是一種淋巴管內皮標志物的跨膜唾液酸糖蛋白， podoplanin陽性CAFs在EGFR-酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)耐藥中扮演著重要的角色，有可能是一個理想的治療靶標[24]。另外，IL-6家族細胞因子抑瘤素M(OSM)是誘導EMT表型的關鍵分子，并通過Janus蛋白酪氨酸激酶1(JAK1)/STAT3通路調控靶向治療耐藥誘導的細胞凋亡[25]。NSCLC細胞和CAFs之間的相互作用主要通過激活OSM/STAT3通路，并通過旁分泌機制抑制靶向藥物的敏感性。

3.4 線粒體轉移

CAFs除了影響細胞代謝重編程外，線粒體轉移也是CAFs調控腫瘤細胞特性的重要機制之一。通過細胞間的橋梁可以傳遞CAFs來源線粒體。腫瘤CAFs線粒體作為能量傳感器，將CAFs代謝重編程和細胞線粒體依賴性傳遞給腫瘤細胞[26]。

4 靶向CAFs治療肺癌策略

CAFs作為最重要的TME的細胞成分，在腫瘤發展過程中發揮重要的角色。針對CAFs的靶向整合治療策略有可能突破TME對腫瘤細胞的保護作用，具有非常好的前景。

4.1 靶向CAFs解除TME對免疫細胞的抑制作用

TME對免疫細胞具有明顯抑制作用，靶向TME的CAFs可以增強系統性抗腫瘤免疫反應，包括多種類型的細胞毒性CD8+T淋巴細胞反應、自然殺傷細胞(NK細胞)活性等[27]。這為腫瘤免疫治療聯合靶向CAFs提供了一個新的免疫治療策略。

4.2 靶向CAFs的活性氧(ROS)信號抑制炎性TME

針對CAFs異質性可以開發新的治療策略。纖維母細胞向CAFs轉化需要依賴于ROS，ROS是通過NADPH氧化酶4(NOX4)產生的。因此抑制NOX4的藥物可能靶向CAFs的轉化，從而對多種腫瘤有廣泛的適用性。另外，CAFs還通過ROS促進免疫抑制及骨髓源性抑制細胞(MDSCs)向肺鱗狀細胞癌發展。

4.3 靶向CAFs抑制腫瘤細胞自噬

靶向CAFs調控的腫瘤細胞自噬是腫瘤治療的重要途徑之一。CAFs分泌IGF1/2、趨化因子CXCL12和β-羥丁酸(β-hydroxybutyrate)等物質能夠誘導腫瘤細胞自噬，從而保護腫瘤細胞免于放射或藥物殺傷[28]。CAFs調節腫瘤自噬機制與ROS產生、蛋白磷酸酶2A(PP2A)活性及抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)激活有關。靶向腫瘤CAFs的自噬調節通路可能是一種有前途的增加放療敏感性的策略[29]。

4.4 CAFs的靶向策略

CAFs及間充質細胞容易進入腫瘤組織，經過工程化改造的基質細胞可以摧毀TME[30]。CAFs表達多個特異標志物，如富含亮氨酸重復蛋白15(LRRC15)表達在肺癌和多種實體腫瘤的CAFs上。LRRC15通過TGF-β誘導激活成纖維細胞和間充質干細胞表達α-平滑肌動蛋白(α-SMA)。靶向LRRC15陽性CAFs已經證明是一種有效的腫瘤治療策略[31]。CD44是CAFs的功能性分子并在TME中維持腫瘤干細胞數量和干性。利用CD44抗體藥物可以靶向CAFs起到治療作用[31]。

總之，隨著對CAFs異質性、代謝紊亂及炎癥環境新調節機制的認識，將指導發展新的靶向TME的治療策略，從而提高肺癌及其他腫瘤的臨床治療效果。