自發性蛛網膜下腔出血早期腦損傷中自噬的研究進展*

米 楊，譚 贏，張繼勤 綜述，尹 浩△ 審校

(1.貴州醫科大學研究生院，貴陽 550025；2.貴州省人民醫院神經外科，貴陽 550002；3.貴州省人民醫院麻醉科，貴陽 550002)

自發性蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是腦血管破裂出血并滲到蛛網膜下腔的神經系統急癥，其中動脈瘤性SAH(aSAH)占50%～80%[1-2]。既往研究發現，SAH后腦血管痙攣(cerebral vasospasm，CVS)是影響患者預后的關鍵因素，經過治療的SAH患者中，30%～70%會發生CVS導致腦缺血[3]。雖然應用內皮素-1(ET-1)受體拮抗劑可以降低CVS發生率，但病死率和預后沒有顯著變化[4]。這表明SAH后CVS并不是影響患者預后的唯一因素。有學者認為，在SAH早期階段腦組織更容易受損，表明早期腦損傷(early brain injury，EBI)可能是導致患者致殘甚至死亡的另一重要原因，包括神經炎癥和微血管功能障礙等損傷[5]。SAH后腦損傷分為EBI和延遲性腦缺血(delayed cerebral ischemia，DCI)。EBI指SAH最初72 h內發生的病理生理變化，而DCI指3～14 d內的缺血性損傷[6-7]，EBI包括短暫腦缺血、血腦屏障損壞、血管痙攣、代謝衰竭、炎癥和氧化應激的發生等[8-9]，都會對神經元造成損傷[10]，而自噬可以在EBI發揮重要作用，包括維持內環境穩定[11]、降低細胞凋亡水平[12]、減輕腦水腫等，合理應用自噬可能為治療SAH帶來新的方向。

1 自噬與EBI相關信號通路

自噬一詞源于希臘語中的“自我”和“進食”，意為細胞通過溶酶體降解細胞內的物質，提供新的物質用于維持細胞的內穩態[13]。在實驗性SAH模型中，自噬可以對EBI包括腦水腫、血腦屏障損傷、神經細胞凋亡等損傷進行改善[14]。研究表明，自噬可能由多種信號傳導通路共同調控，這些通路錯綜復雜，在哺乳動物中，已發現雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路、活性氧(ROS)、核轉錄因子-κB(NF-κB)、Beclin-1、Ras/蛋白激酶A(PKA)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)等信號傳導通路均可能介導自噬的發生，而mTOR、ROS作為多條信號傳導通路的交叉點，是調控自噬的關鍵因素。

1.1 腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/mTOR信號通路

自噬的特點是形成稱為自噬體的雙膜小泡，將細胞質物質降解，為細胞在能量缺乏狀態下提供新的營養物質[15]。AMPK是哺乳動物細胞中能量狀態的主要感受器，其通過感知一磷酸腺苷/三磷酸腺苷(AMP/ATP)和二磷酸腺苷(ADP)/ATP比值從正、反兩個方面調節細胞的能量狀態[16]，一方面促進生成ATP的分解代謝過程，另一方面抑制消耗ATP的合成代謝過程[17-18]。其中，細胞生長和蛋白質翻譯是細胞ATP消耗的主要原因，mTOR作為自噬多條信號傳導通路的交叉點，具有調節蛋白質合成和細胞周期進程的作用，AMPK抑制蛋白質合成的能力是通過直接抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1(mTORC1)來實現的。在結節硬化綜合征(TSC)細胞中，AMPK磷酸化TSC2并激活TSC，從而衰減 mTORC1途徑。此外，AMPK通過磷酸化Ser15來穩定細胞內促凋亡蛋白p53，mTORC1的活化增強p53的翻譯，兩種效應共同作用致使p53在葡萄糖缺乏的TSC細胞中聚集，促使細胞凋亡。研究證明，自噬激活劑雷帕霉素對TSC缺陷細胞中mTORC1的抑制可以維持細胞內ATP水平，并在能量缺乏時抑制AMPK的激活，完整AMPK-TSC信號傳導對于抑制mTORC1通路在能量壓力條件下調控細胞存活和生長是必要的[19]。在EGAN等[20]的研究中，同樣揭示了能量感應和自噬核心蛋白自噬激活激酶1(ULK1)之間的聯系，研究表明當細胞應激時，AMPK可以磷酸化ULK1并使其發揮功能，從而觸發自噬級聯的啟動，而mTORC1通過抑制ULK1的磷酸化而抑制自噬的啟動。可見AMPK既通過直接激活磷酸化ULK1激活自噬，同時抑制mTORC1的活性，解除mTORC1對ULK1的抑制，從正、反向同時促進自噬的激活。此外，在細胞中還存在一種自噬體形成的關鍵膜標記蛋白Vps34，哺乳動物的Vps34存在于不同的復合物中，通過 AMPK的差異調節，可以調節自噬的起始，這是因為AMPK可以通過ATG14L逆轉AMPK對Vps34-Beclin-1復合物活性的抑制作用，經AMPK直接磷酸化Beclin-1，進而激活自噬前體Vps34復合物，促使自噬形成[6，21]。而自噬經由AMPK通路激活后緩解EBI的神經細胞損傷作用已在LI等[22]的實驗中得到了證實。

1.2 PI3K/Akt信號通路

細胞中酪氨酸激酶可以在生長因子、細胞因子等刺激下被激活，經過一系列過程最終激活PI3K，PI3K可以將4,5二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)轉化為3,4,5三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，而10號染色體上缺失的磷酸酶與張力蛋白同源物基因(PTEN)可負性調控PI3K-Akt信號通路致使PI3K的D3位去磷酸化生成PIP2。生成的PIP3使Akt從細胞質轉移到細胞膜上，然后血小板-白細胞C激酶與PIP3共同導致Akt構象改變，同時使Thr308和Ser743磷酸化，這些使Akt激活，進而抑制細胞凋亡并通過抑制半胱氨酸蛋白酶-9(caspase-9)活性阻止凋亡級聯反應的激活[23]。另外，mTOR作為Akt的下游分子，結節性腦硬化復合物-1(TSC-1)和TSC-2形成二聚體復合物抑制mTOR的功能，但是活化的Akt可以抑制TSC-1/TSC-2復合物的形成，而解除其對mTOR的抑制功能，使mTOR激活；Akt也可以直接作用mTORC1使mTOR激活。激活的mTOR調控核糖體S6蛋白激酶(S6K)、真核生物啟動因子4E結合蛋白1(4E-BP1)，對特定的mRNA翻譯及蛋白質合成進行調控[24]。YU等[25]研究表明，P13K/Akt通路激活在減輕SAH誘導的腦損傷方面具有重要作用；而SUN等[26]研究中對大鼠SAH模型給予κ阿片受體激動劑Salvinorin A，在EBI期可改善神經元凋亡，同時Bax和半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)表達下調，表明自噬可能通過PI3K/Akt信號通路參與EBI。

1.3 ROS信號通路

SAH作為一種神經系統急癥，其發生時會產生一系列可以氧化蛋白質、脂類及核酸等物質的ROS分子，這些ROS分子在SAH的EBI階段可發揮激活自噬的作用。當細胞受到外界損傷刺激時，約90%的ROS由線粒體內膜呼吸鏈產生超氧自由基形成，隨著細胞內產生ROS并逐漸累積增多，為維持細胞內穩態，激活缺氧誘導因子1(HIF1)并產生轉錄物質腺病毒E1B19000相互作用蛋白3(BNIP3)和類腺病毒E1B19kD蛋白相互作用蛋白3同源物(NIX)，它們的翻譯蛋白與線粒體膜上的Beclin-1競爭結合Bcl-2，從而釋放自噬的重要分子Beclin-1并介導自噬激活。在氧化應激或缺氧狀態下，內質網壓力感受器被激活，其下游可促進自噬基因LC3和ATG5表達并激活自噬。除上述途徑外，氧化應激還可以激活FOXO3和NRF2，FOXO3刺激LC3和BNIP的表達，NRF介導p62的轉錄，p62轉錄的同時促進NRF2的轉錄。所有的轉錄活動都能正向調節自噬的發生。抑癌基因p53可以轉錄激活許多自噬相關基因。在這些基因中，調控DNA損傷的自噬分子(DRAM)和Sestrins基因對自噬起正向激活作用，而這些基因與ROS之間的關系并不明確。在p53激活的基因中，TP53誘導的糖酵解和凋亡調節因子(TPGAR)作為一種p53靶點的蛋白，負向調節自噬，表明其作用與p53無關。同時，ROS抑制ATG4蛋白酶的活動進而促進自噬小體的形成[27]。而在CHEN等[28]的研究中發現，自噬可以由褪黑素激活進而減輕EBI，減少神經細胞凋亡。由此可見，EBI可以釋放一系列ROS對神經細胞造成損傷，同時也可以通過自噬的激活保護神經細胞免于凋亡。

2 自噬參與SAH的EBI階段

研究表明，SAH后的EBI階段，Beclin-1及其他相關指標表達顯著升高，在電鏡下可發現多膜胞質空泡、核收縮、線粒體腫脹和自噬小泡等，表明受損神經細胞內自噬溶酶體途徑激活[29-30]。此外，EBI后內質網內的鈣離子釋放進入細胞質內，鈣離子濃度升高通過1,4,5-三磷酸肌醇受體(IP3R)激活鈣調蛋白依賴性蛋白激酶(CaMKK)/AMPK通路，解除mTOR對ULK1復合物的抑制作用，單獨使用鈣離子動員劑使細胞內鈣離子濃度升高仍可促進自噬激活[29-30]。電鏡觀察發現，SAH后溶酶體完整性被破壞，致使細胞內損壞的線粒體聚集，同時激活自噬。

2.1 自噬與EBI的氧化應激

SAH伴隨而來的氧化應激可產生ROS，對蛋白質、脂質和核酸都有毀滅性損傷；此外，存在于蛛網膜下腔的血液降解為高鐵血紅蛋白、血紅素等物質，參與EBI[31-33]，這些ROS物質隨著腦脊液的流動而遍布整個中樞神經系統[34]，同時激活自噬進而減輕EBI帶來的神經細胞凋亡[28]。FUMOTO等[35]研究顯示，在SAH模型中應用依達拉奉后可以阻止基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的表達和激活，并減少血腦屏障的主要構成因素緊密連接蛋白的降解，這在應用其他抗氧化劑的實驗中亦得到了驗證[36]。除緊密連接以外，血管內皮細胞也是構成血腦屏障的重要成分，FUMOTO等[35]同時發現內皮細胞的凋亡水平下降并可維持內皮細胞屏障功能，這種預防作用間接表明氧化應激可以介導EBI內皮細胞凋亡。

2.2 自噬與EBI的神經炎癥

LC3是自噬體的生物標記物，Beclin-1是一種在自噬中有重要作用的Bcl-2相互作用蛋白。LC3和Beclin-1被普遍認為是自噬的標記物，在自噬體形成過程中表達增加，同時刺激一種細胞溶酶體降解酶組織蛋白酶D(cathepsin D)的表達。LEE等[30]研究發現，在SAH后24 h內，LC3-Ⅱ、Beclin-1和cathepsin D水平逐漸上升；WANG等[14]同樣證實了自噬的激活，并表明自噬在24 h達到峰值，在48 h逐漸恢復正常水平，緩解了EBI對神經細胞的損傷。在神經炎癥方面，促炎性晚期糖基化終產物受體(the receptor for advanced glycation end products，RAGE)在EBI中具有調節自噬和凋亡的作用，抑制RAGE可顯著增加SAH后caspase-3和bax的裂解水平，并降低Bcl-2水平。阻斷RAGE可減少SAH引起的LC3-Ⅱ和Beclin-1上調，并減少神經炎性細胞因子，表明RAGE在神經炎癥方面同樣有調節作用，NF-κB借助RAGE途徑刺激神經炎性介質發揮主導作用[37]。在SAH后24 h抑制RAGE可以阻止小膠質細胞的活化及腫瘤壞死因子(TNF)、白細胞介素(IL)-1β和環氧合酶-2(COX-2)的釋放，而RAGE被阻斷時，caspase-3和bax水平升高，LC3和Beclin-1水平降低，表明抑制RAGE將促進細胞的凋亡并抑制自噬特異因子的表達[38]。RAGE對于SAH后神經細胞凋亡與自噬之間的平衡反饋，可為改善SAH預后提供潛在的靶點。

2.3 自噬的激活與抑制

在實驗性SAH模型中，應用雷帕霉素(一種自噬激活劑)的小鼠早期LC3和Beclin-1水平顯著升高，24 h達高峰，其臨床行為量表上的改善優于對照組SAH大鼠；而應用3-甲基腺嘌呤(一種自噬抑制劑)的小鼠與前者正好相反，其神經功能缺損加重，表明自噬的激活對EBI有一定的修復作用[14]。在改良SAH模型中，也發現使用3-甲基腺嘌呤或渥曼青霉素治療會降低大鼠神經功能評分，增加神經元凋亡，而雷帕霉素和預防性辛伐他汀聯合應用可提高自噬活性，抑制細胞凋亡[39]。在這個過程中，自噬激活可以抑制線粒體凋亡途徑，減少了神經細胞凋亡，從而有效地改善EBI[40]。自噬的另一種激活劑褪黑素同樣可以降低caspase-3的活性和凋亡活性，包括提高LC3-Ⅱ/LC3-I比值，表明褪黑素激活自噬可改善SAH后大鼠細胞的凋亡，進而支持了自噬對EBI的保護作用[28]。

3 小 結

本文重點闡述了自噬在SAH后EBI階段發揮的重要作用，自噬激活可以保護神經細胞免于凋亡進而減輕SAH造成的腦損傷，而調控自噬的主要信號通路是AMPK/mTOR信號通路，自噬激活劑可能通過磷酸化ULK1蛋白觸發自噬級聯反應的啟動，為SAH患者預后提供了新方向。適當的自噬激活可以為SAH患者帶來有益的方面，而長期自噬狀態的持續和過度的自噬均會導致神經細胞發生程序性死亡，給神經功能帶來一定的損傷。為此，需要更深入的研究自噬在EBI的作用機制，通過RAGE這樣潛在的靶點調控凋亡與自噬之間的平衡，使SAH后自噬朝著有利的方向發展。自噬參與SAH神經保護像一把雙刃劍，必須在激活自噬的同時并對自噬進行控制，使其在整個疾病的過程中發揮有益的作用而避免對神經細胞的損傷，故選擇適合的激活劑與自噬的調控靶點是下一步研究方向。因此，需要更深入地研究SAH和自噬調控的具體機制，并探究二者之間的具體關系，為SAH治療提供新的策略。