慢性疾病癥狀在高雄激素化動物模型的研究進展

孫立峰，全軍民

(北京大學(xué)深圳研究生院，化學(xué)生物學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，腫瘤化學(xué)基因組學(xué)國家重點實驗室，廣東 深圳 518055)

慢性疾病指非傳染性，病程長且病情遷延不愈的疾病總稱。這類疾病包括癌癥、高血壓、糖尿病等。隨著人均壽命延長，慢性病的發(fā)生率增加。在研究多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)相關(guān)問題過程中發(fā)現(xiàn)高雄激素化動物模型表現(xiàn)了多種疾病癥狀，包括脂代謝紊亂、慢性炎癥等，具有慢性疾病特征，因此慢性疾病的研究可以借助這一類模型加以開展實施。

給予外源雄激素刺激可以導(dǎo)致動物血液雄激素濃度增加，伴隨生殖、代謝紊亂癥狀表現(xiàn)。作為研究對象，這些動物便是高雄激素化動物模型。高雄激素化動物模型廣泛用于高雄激素血癥、PCOS相關(guān)研究。PCOS主要癥狀為臨床/生化高雄激素血癥、稀缺排卵、多囊性卵巢，此外還會表現(xiàn)的癥狀包括胰島素抵抗、高血糖、高血脂、脂肪肝、動脈粥樣硬化、失眠等。現(xiàn)有信息顯示，雄激素化動物模型應(yīng)用于生殖、代謝癥狀的研究具有合理性，并且適用于研究相應(yīng)內(nèi)容。而進一步分析這些信息我們還會知道哪些研究需要補充，哪些研究方法可以改善當(dāng)前模型局限性。

雄激素化動物模型以脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)和雙氫睪酮(dihydrotestosterone，DHT)誘導(dǎo)的高雄激素化大、小鼠最為常用。當(dāng)前綜述的目的在于促進不同領(lǐng)域的研究者了解以上兩種雄激素建立的嚙齒動物疾病模型，進而更好利用這些模型研究不同的問題。之前對這些動物模型的綜述僅關(guān)注生殖特征，而鮮有代謝等內(nèi)容的報道。本綜述在總結(jié)生殖特征的同時還會討論：肥胖、糖代謝、脂代謝、心血管癥狀、慢性炎癥和生物節(jié)律紊亂。

1 動物模型的建立

1.1 DHEA嚙齒動物模型的建立過量的雄激素會引起多毛癥、排卵障礙和囊性卵巢，這些癥狀普遍存在于PCOS患者群體。PCOS患者，相對健康女性，有更高濃度的血清DHEA，高達2.6倍[1]。同時，PCOS患者表現(xiàn)癥狀多開始于青春期，此時DHEA及其衍生物是主要的雄激素活性形式[2]。根據(jù)以上信息，研究提出假說——雄激素、DHEA、誘導(dǎo)了PCOS樣癥狀。

在1962年，Roy[3]使用DHEA處理大鼠，使大鼠表現(xiàn)了囊性卵泡特征。1991年，Lee等[4]首次報道DHEA處理大鼠可以表現(xiàn)高雄激素血癥、動情周期紊亂、囊性卵泡等PCOS樣癥狀。2008年，有報道顯示DHEA處理小鼠也具有大鼠類似的癥狀[2]。這些嚙齒動物模型的制作過程描述如下：22-27日齡(青春期前)雌性大鼠(小鼠)每天接受DHEA皮下注射(劑量為60 mg·kg-1體質(zhì)量，溶解于0.1-0.2 mL的中性油)，持續(xù)20 d[4]。

1.2 DHT嚙齒動物模型的建立雖然DHEA可以誘導(dǎo)PCOS樣癥狀，但是DHEA在體內(nèi)會轉(zhuǎn)化為雌二醇(estradiol，E2)——一種雌激素，以致難以確定癥狀的產(chǎn)生是雌激素的作用還雄激素的作用。為了避免這種困擾，研究者嘗試用不能在體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榇萍に氐腄HT——一種雄激素取代DHEA來建模[5]。DHT建模也有病理基礎(chǔ)，因為DHT在PCOS群體中是健康群體中血液濃度的1.7倍[5]。

在2007年， Manneras首次報道了持續(xù)暴露于DHT刺激可以誘導(dǎo)大鼠表現(xiàn)PCOS樣癥狀[5]。在2012年，Houten報道DHT處理小鼠也可以表現(xiàn)PCOS樣癥狀。DHT處理過程如下：將21日齡大鼠(小鼠)皮下埋置DHT緩釋片，緩釋片包含7.5 mg DHT(小鼠用緩釋管含有2.5 mg DHT),每天的劑量約為83 μg(27.5 μg)，動物被處理60-90 d[5-6]。

2 動物模型生殖特征的分析

2.1 動情周期紊亂的分析DHEA和DHT處理的大、小鼠具有動情周期紊亂癥狀，如持續(xù)間情期或持續(xù)動情期[4-6]。月經(jīng)紊亂(人)和動情周期紊亂(鼠)反應(yīng)的是子宮功能相關(guān)的生殖異常。PCOS具有月經(jīng)過少癥狀。

但是，如果DHEA刺激的持續(xù)時長從20 d延長到90 d，那么DHEA處理小鼠與對照組小鼠動情周期無明顯差異[7]。一種可能的解釋是，在DHEA處理20 d的實驗中，小鼠處于41日齡，它們沒有完成性成熟(35-45日齡)和機體成熟(65-75日齡)，它們沒有能力高效的轉(zhuǎn)化DHEA以維持激素穩(wěn)態(tài)，因而導(dǎo)致了卵巢、子宮生殖器官的形態(tài)和功能異常。而處理90 d的實驗中，小鼠處于101日齡，它們達到了機體成熟的狀態(tài)，能夠及時的轉(zhuǎn)化DHEA，緩解、避免相應(yīng)癥狀。這提示DHEA處理應(yīng)在青春期內(nèi)進行，并在青春期內(nèi)完成相關(guān)癥狀、指標(biāo)的觀察、檢測。

另外，DHT可能對陰道上皮細胞具有直接作用。正如腦、卵巢組織器官特異性敲除雄激素受體(androgen receptor，AR)小鼠中觀察到的，當(dāng)AR在腦或卵巢中敲除時，雖然PCOS相關(guān)癥狀，如囊性卵巢、脂肪肝等得到緩解，但是小鼠仍表現(xiàn)動情周期紊亂癥狀，陰道涂片中含有大量白細胞[8]。由于這一現(xiàn)象機制尚不清楚，因此需補充雄激素對子宮直接作用相關(guān)研究，涉及上皮細胞分化、局部免疫反應(yīng)。DHEA和DHT模型均適用研究月經(jīng)紊亂疾病。

2.2 卵巢形態(tài)異常的分析無論是DHEA還是DHT，都可以誘導(dǎo)大、小鼠表現(xiàn)囊性卵巢。囊性卵泡的特征是完整的卵泡膜包裹著被擠壓變薄的顆粒細胞層，中間是充滿液體的空腔。這些卵泡的壁層顆粒細胞數(shù)目減少，血管化的卵泡膜內(nèi)層缺失[4-6]。雖然在囊性卵巢中仍有正常的卵泡存在，但是閉鎖卵泡等畸形卵泡數(shù)量是增加的[4，6]。PCOS患者常有多囊性卵巢癥狀，表現(xiàn)為卵巢體積增加(單側(cè)卵巢體積≥10 mL)，小卵泡數(shù)目增加(≥25個)，卵巢基質(zhì)肥大。

DHEA使用的劑量和處理持續(xù)時長決定著囊性卵巢的產(chǎn)生和嚴(yán)重程度[3-4]。給大鼠注射不同劑量DHEA(0.1、0.3、1、3、10、30 mg·kg-1)，囊性卵巢僅在10、30 mg·kg-1處理組中被觀察到[3]。處理后d 10可以看到卵巢中出現(xiàn)囊性卵泡，d 20大約88%的大鼠會表現(xiàn)囊性卵巢癥狀[7]。值得注意的是，當(dāng)DHEA處理的持續(xù)時長由20 d延長到90 d，小鼠實驗顯示，DHEA組和對照組卵巢形態(tài)無明顯差別[4]。

以上信息提示，高雄激素誘導(dǎo)的卵巢囊性改變是可逆的，我們的實驗結(jié)果證明了這一點。去除PCOS樣小鼠外源DHT，經(jīng)1個月的飼養(yǎng)后，卵巢形態(tài)明顯恢復(fù)，囊性卵泡減少，黃體出現(xiàn)，卵巢基質(zhì)增生得到緩解[9]。

通常認為高雄激素血癥干擾大腦中的神經(jīng)環(huán)路，破壞了性激素反饋機制和促性腺激素分泌規(guī)律，從而導(dǎo)致排卵障礙。如給予神經(jīng)細胞特異性敲除AR小鼠DHT處理，這種處理會導(dǎo)致野生型小鼠表現(xiàn)PCOS樣癥狀，基因敲除鼠雖在卵巢中出現(xiàn)囊性卵泡，但同時出現(xiàn)了與健康小鼠相似的黃體數(shù)目[8]。與此類似，將全身性敲除AR的小鼠進行DHT處理，處理過程中用外源野生型小鼠的卵巢取代原有卵巢，處理結(jié)束時可以觀察到這些小鼠具有規(guī)律的動情周期和正常的黃體數(shù)目，但是也有囊性卵泡存在[8]。對囊性卵泡存在的一種推測是卵泡細胞自身的AR也在囊性卵泡的形成中起到了作用。與卵泡細胞不同，卵巢基質(zhì)細胞似乎明顯受神經(jīng)細胞AR的控制，在以上兩種基因缺失小鼠中均未出現(xiàn)卵巢基質(zhì)增生現(xiàn)象[8]。由于雄激素對不同細胞作用差異性不甚清楚，因此需補充雄激素對卵巢不同細胞，卵泡細胞和卵巢基質(zhì)細胞的作用相關(guān)研究，涉及細胞的代謝、分化和凋亡。

DHT處理的大鼠具有卵巢質(zhì)量降低、體積減小的特征[5]，這與PCOS患者表現(xiàn)的癥狀相反。這可能與DHT處理動物生長卵泡更少有關(guān)。PCOS多囊性卵巢的一個特征是生長卵泡數(shù)目的增加，但是DHT處理的動物沒有這一癥狀。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在DHT處理小鼠僅存的有腔卵泡中，顆粒細胞黃體化受到了抑制(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，在正常黃體化顆粒細胞表達的CYP11A1等黃體化標(biāo)記物在DHT處理小鼠中是缺少的。mRNA分析顯示，DHT不僅抑制了顆粒細胞黃體化相關(guān)基因表達，還進一步抑制了排卵相關(guān)基因表達，如Prlr、Lhcgr、Ptgfr、Areg、Tnfaip6、Ptgr1等。我們進一步使用顆粒細胞進行體外研究發(fā)現(xiàn)，DHT處理細胞可以導(dǎo)致類似在體的顆粒細胞活性變化，說明DHT對顆粒細胞有直接作用。DHT對小鼠的這一作用也可以通過短期的高濃度DHT處理實現(xiàn)。這可能是在AR卵巢外敲除后，仍有囊性卵泡形成的原因之一。而同時開展的研究顯示，DHEA對顆粒細胞黃體化活性沒有明顯影響。另一方面，卵巢基質(zhì)增生也是PCOS患者中的普遍癥狀[10]，而這一癥狀DHT處理動物較DHEA處理動物更為嚴(yán)重。以上信息提示， DHEA和DHT模型都適用于以卵泡發(fā)育異常為特征的卵巢疾病，并且DHEA模型適用于卵泡過度生長問題的研究，而DHT模型則適用于有腔卵泡黃體化障礙的研究。此外，DHT模型還適用于如卵巢基質(zhì)細胞肥大等細胞代謝異常的研究。

2.3 血液性激素異常的分析DHEA和DHT誘導(dǎo)的高雄素化動物血液對應(yīng)的外源雄激素處于高濃度。血液中高濃度的游離睪酮是PCOS重要診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。除了睪酮水平異常，其它種類的激素異常也在PCOS患者常見，如高頻率的促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)濃度波動，高水平的黃體化激素(luteinizing hormone，LH)與促卵泡生成素(follicular stimulating hormone，F(xiàn)SH)比值，高濃度DHEA、DHT[10]、促乳素(prolactin，PRL)等。

與PCOS患者相似，長時間高濃度DHEA處理動物也表現(xiàn)血液激素異常。在DHEA誘導(dǎo)PCOS的大鼠模型建立時，研究者Lee便關(guān)注到了血液激素特征。在DHEA大鼠模型中，相對于無處理組，DHEA組大鼠血清具有更高濃度的雄激素[雄酮(androsterone，4A)、 睪酮(testosterone，T)、 DHT]、雌激素[(雌酮(estrone，E1)、 雌二醇(estradiol，E2)]、孕酮(progesterone，P4)和促乳素。在這次研究中，還發(fā)現(xiàn)催乳素、LH與囊性卵泡數(shù)目具有相關(guān)性，具有囊性卵泡的大鼠，相對無囊性卵泡的大鼠，血液中催乳素、LH水平更高[7]。使用高濃度DHEA持續(xù)刺激小鼠，也觀察到增加了血液中T、E2和P4的濃度[11]。此外，DHEA也升高了血液前列腺素E(prostaglandin E，PGE)、抑制素β濃度(inhibin β，INHB)[11]。

但是，在DHT動物模型中沒有明顯的激素異常，無論是大鼠還是小鼠，DHT均未改變它們的血液P4、E2和T濃度[5，7]。并且，對于小鼠而言，是否有DHT刺激也不影響血液FSH和LH濃度[7]。與健康個體相比，抗繆勒管激素(anti-mullerian hormone，AMH)在PCOS患者也處于濃度過高狀態(tài)。但是，DHT處理的小鼠與無處理小鼠具有相同生長卵泡數(shù)目的情況下，兩者的血液AMH沒有明顯差異[6]。雖然DHT沒有改變卵巢的激素合成分泌，但是它改變了卵巢對促性腺激素的反應(yīng)活性，DHT抑制了FSH誘導(dǎo)的雌激素合成過程(大鼠)[10]。

大鼠和小鼠由于自身可以合成充足的DHEA和DHT，并實現(xiàn)相應(yīng)功能，而且存在調(diào)節(jié)機制，故可以維持其相對穩(wěn)定狀態(tài)。因此需要補充“外源DHEA/DHT引起的DHEA/DHT合成相關(guān)變化與疾病條件下自發(fā)的合成變化可比性評估”。如已知在PCOS患者中常見卵巢高表達CYP17A1，但DHEA或DHT動物模型呈現(xiàn)表達降低，提示DHEA/DHT雄激素化模型不適用于高雄激素血癥等問題的研究。

3 動物模型代謝特征的分析

3.1 肥胖的分析DHT或者DHEA處理都可以導(dǎo)致大鼠和小鼠有更高的體質(zhì)量獲得量，呈現(xiàn)肥胖傾向[5-7，12-13]。PCOS患者群體中約50%的個體處于肥胖狀態(tài)。

遺傳背景可以影響DHEA引起的體質(zhì)量增加。相較于BABLC小鼠，C57小鼠受到DHEA刺激后更早出現(xiàn)肥胖傾向。并且DHEA處理相同時間長度內(nèi)，C57小鼠有更高的體質(zhì)量獲得量[12]。但是，在DHEA導(dǎo)致體質(zhì)量增加時，脂肪質(zhì)量與體質(zhì)量比、內(nèi)臟脂肪質(zhì)量是下降的[13]。一種可能的解釋為DHEA增加體質(zhì)量不僅通過增加脂肪，還可能源于對肌肉組織的增加。延長DHEA處理時間也不會明顯增加脂肪含量，如將DHEA處理C57小鼠的時間由20 d延長到90 d，DHEA處理小鼠與無處理小鼠的脂肪細胞尺寸是相似的[7]。

高脂飲食可以促進DHEA誘導(dǎo)的體質(zhì)量增加。雖然較單一高脂飲食相比，DHEA加高脂飲食處理小鼠具有更低體質(zhì)量值。但相較于單一DHEA處理，DHEA加高脂飲食使小鼠在處理期內(nèi)的d 5到d 20都具有更高的體質(zhì)量值，這時增加的體質(zhì)量源于增加的總脂肪質(zhì)量，尤其是內(nèi)臟脂肪質(zhì)量[13]。與此同時，可以觀察到兩組小鼠的瘦肉質(zhì)量與體質(zhì)量比值是沒有顯著差異的[13]。與單一DHEA刺激一樣，DHEA加高脂飲食也可以誘導(dǎo)卵巢囊性病變[13]。單一高脂飲食可以誘導(dǎo)動物糖脂代謝紊亂，但囊性卵巢發(fā)生率低，且癥狀不典型。DHEA和高脂飲食存在交互作用， DHEA加高脂飲食誘導(dǎo)動物表現(xiàn)多種癥狀更接近人的臨床表現(xiàn)。以上信息提示，外源DHEA刺激結(jié)合遺傳因素、飲食條件可以更有效的誘導(dǎo)體脂增加和肥胖的發(fā)生。單純DHEA刺激不適用于研究肥胖相關(guān)問題，但DHT模型適用肥胖問題的研究。

DHT處理的大鼠具有更高的體質(zhì)量值，此種狀態(tài)下體脂質(zhì)量和骨骼肌質(zhì)量都更重。但是增加的體質(zhì)量主要來源于體脂[5]。以脛骨前肌肉為例，雖然DHT引起了它的質(zhì)量增加，但是脛骨前肌與體質(zhì)量的比值卻在DHT刺激下是減小的[5]。與肌肉組織不同，脂肪組織，包括腹股溝脂肪、腹膜下脂肪，在質(zhì)量增加的同時，他們相對體質(zhì)量的比例也是增加的[5]。進一步的形態(tài)學(xué)分析可以觀察到，與無處理小鼠相比，DHT處理大鼠有更大的脂肪細胞尺寸[5]。而對于小鼠來說，DHT處理可以引起類似于大鼠的體質(zhì)量、體脂、脂肪細胞尺寸變化[6-7，9]。

神經(jīng)細胞特異性的雄激素受體(AR)抑制能夠緩解DHT誘導(dǎo)的體質(zhì)量增加和脂肪細胞肥大。與野生型小鼠相比，神經(jīng)細胞特異性敲除AR的小鼠在DHT處理時肥胖傾向不明顯，并且脂肪細胞尺寸保持了相對較小的狀態(tài)[9]。但是，卵巢組織特異性缺失AR對DHT誘導(dǎo)的代謝癥狀則無明顯緩解作用[9]。以上信息提示，DHT引起的神經(jīng)細胞活性改變是體脂增加的前提。為了揭示雄激素影響體脂的途徑和方式，需要補充利用雄激素化動物模型研究神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機制相關(guān)內(nèi)容。

去除雄激素化小鼠模型的外源DHT，模型小鼠相對無處理小鼠仍然更重，我們的研究提示至少在停止外源DHT刺激一個月內(nèi)是如此。在這時，卵巢形態(tài)與功能已得到明顯恢復(fù)。而在使用二甲雙胍緩解了DHT處理小鼠的血脂異常時，沒有明顯影響體質(zhì)量(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。以上信息提示肥胖，高體脂比率，不是雄激素引起卵巢、血脂異常的決定性因素。

3.2 糖代謝異常的分析PCOS患者群體中有70%的患者具有糖代謝紊亂癥狀，主要表現(xiàn)為胰島素抵抗。目前沒有報道DHEA對大鼠的糖代謝的影響，而現(xiàn)有的數(shù)據(jù)顯示DHEA沒有改變小鼠的糖代謝過程[12]。與DHEA不同，DHT可以擾亂大鼠和小鼠的糖代謝活動[5-6]。DHT模型適用于糖代謝紊亂疾病的研究。雖然在不同的獨立研究中，糖代謝評價是可能通過不同指標(biāo)實現(xiàn)的，這些方法包括空腹血糖、空腹胰島素、糖灌注率(glucose infusion rate，GIR)、糖耐量和胰島素敏感性指數(shù)，但是評價結(jié)果均支持以上DHEA、DHT展示的效應(yīng)。

DHEA誘導(dǎo)的PCOS小鼠沒有糖代謝紊亂癥狀。即便將DHEA處理的持續(xù)時間由20 d延長到90 d，DHEA處理小鼠和無處理小鼠空腹血糖值是相似的[7]。雖然DHEA處理小鼠沒有出現(xiàn)血清胰島素增加的現(xiàn)象，但是肝組織可能存在糖代謝異常，如轉(zhuǎn)導(dǎo)胰島素信號的分子p-Akt在DHEA處理下，相較于無處理小鼠濃度降低[5]。遺傳背景對DHEA處理小鼠的糖代謝狀態(tài)影響有限，雖然C57/BL6小鼠表現(xiàn)高空腹血糖癥狀時BALB/c小鼠卻維持血糖在正常水平，但是DHEA處理與否沒有引起同一品種小鼠糖代謝的明顯差異[12]。高脂飲食結(jié)合DHEA處理小鼠表現(xiàn)糖代謝異常，與單一高脂飲食相比，DHEA加高脂飲食處理小鼠的這些癥狀更嚴(yán)重，DHEA和高脂飲食存在交互作用。與單一DHEA處理相比，DHEA結(jié)合高脂飲食處理的小鼠表現(xiàn)了胰島素抵抗、葡萄糖耐受癥狀[12]，適用于糖代謝紊亂疾病的研究。

DHT模型具有糖代謝異常癥狀，無論是大鼠還是小鼠。DHT處理導(dǎo)致大鼠葡萄GIR降低、胰島素敏感性指數(shù)減小，表現(xiàn)胰島素抵抗癥狀[5]。小鼠也表現(xiàn)類似的糖代謝異常，如腹腔注射葡萄糖耐量實驗觀察到，在注射葡萄糖后的每個時間點均是DHT小鼠具有更高的血糖值[6]。雖然DHT處理小鼠胰島素水平?jīng)]有明顯變化。以胰腺的胰島β細胞功能紊亂為特征的糖代謝紊亂在PCOS群體中較為常見，可能DHT能夠引起胰島β細胞發(fā)生相應(yīng)的變化[14]。大鼠實驗過程中發(fā)現(xiàn)，是否DHT處理對基礎(chǔ)胰島素分泌沒有影響，但是DHT處理降低了胰島在葡萄糖刺激下的胰島素合成分泌(glucose-stimulated insulin secretion，GSIS)[14]。DHT處理還導(dǎo)致了線粒體增殖、氧消耗和三磷酸腺苷合成相關(guān)基因的表達抑制[14]。相對未處理大鼠，來自DHT處理大鼠的胰島含有更高濃度的AR蛋白。并且使用flutamide拮抗AR活性，或使用siRNA降低AR表達，可以緩解DHT引起的GSIS紊亂。據(jù)此可以進一步推測，DHT以AR依賴的方式，通過破壞線粒體功能，誘導(dǎo)β細胞功能紊亂[14]。

GSIS紊亂會增加PCOS相關(guān)癥狀的風(fēng)險，如心血管疾病。Tepavevi等發(fā)現(xiàn)，DHT雖然沒有改變心臟細胞胰島素受體、胰島素受體底物1和下游分子Akt的表達，但是它抑制了GLUT1/4，導(dǎo)致了糖攝取障礙。因為胰島素在機體細胞存在廣泛活性，但目前研究有限，因此需要補充雄激素刺激下不同種類細胞的胰島素反應(yīng)活性變化。

3.3 脂代謝異常的分析對脂代謝的影響，DHEA和DHT具有差異。脂代謝紊亂常見高濃度血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerides，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)，低濃度血清高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)。PCOS群體中約50%的個體具有脂代謝紊亂癥狀。

DHEA誘導(dǎo)小鼠表現(xiàn)PCOS相關(guān)癥狀時沒有改變?nèi)硇缘闹x，包括血清TC、TG[5]。在肝臟局部，與未處理小鼠比，DHEA處理小鼠Cd36/Fat等降低脂肪積累的分子濃度增加，同時Srebp-1和Dgat2等促進脂積累的分子濃度降低[13]。在外周和組織局部的有無變化方面，與血糖情況類似。以上信息提示，DHEA引起以脂質(zhì)過度積累為特征的脂代謝紊亂可能性低，DHEA模型不適用脂代謝紊亂相關(guān)問題研究。

高脂肪飲食能夠誘導(dǎo)DHEA處理小鼠發(fā)生脂代謝紊亂，與單一DHEA處理相比，高脂肪飲食結(jié)合DHEA處理小鼠具有更高的血清TC濃度、更低的血清TG濃度[13]。在肝臟，聯(lián)合處理較DHEA單獨處理小鼠減少了負責(zé)膽固醇穩(wěn)態(tài)的LXRs(liver X receptors)表達[13]。DHEA結(jié)合高脂肪飲食可以誘導(dǎo)小鼠發(fā)生脂代謝紊亂。這種改良的DHEA模型適用于脂代謝紊亂相關(guān)問題研究。

DHT處理的大鼠脂代謝也沒有出現(xiàn)異常，包括血漿TC、TG，此外，游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)和高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)也與未處理大鼠沒有明顯差別[5]。但是兩種調(diào)節(jié)脂代謝的激素，leptin 和 adiponectin， 在DHT處理大鼠與未處理大鼠間具有明顯差異，DHT處理大鼠具有更高水平的leptin和更低水平的adiponectin[5-6]。PCOS患者也具有類似癥狀[15]。因為沒有相關(guān)報道，所以不確定DHEA處理的大鼠或小鼠是否leptin和adiponectin處于異常水平。與DHT處理大鼠有不同，DHT處理小鼠，相對未處理小鼠，具有更高的血清TC、TG濃度[7，9]。此外，DHT處理的大鼠或小鼠都具有脂肪細胞肥大[7-8]、肝細胞脂肪變性[7-8]癥狀。以上信息提示，DHT能引起以脂質(zhì)過度積累為特征的脂代謝紊亂，DHT小鼠模型適用于肥胖、非酒精性脂肪肝等疾病的研究。

抑制雄激素可以緩解糖脂代謝紊亂，但可能相比于改善卵巢功能較遲鈍。在我們的研究中，DHT誘導(dǎo)小鼠表現(xiàn)生殖、代謝癥狀后去除外源DHT，飼養(yǎng)小鼠30 d后進行觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DHT處理小鼠的卵巢形態(tài)、基因表達趨向與無處理小鼠一致時，脂肪組織和肝臟形態(tài)和脂代謝相關(guān)基因表達仍處于異常狀態(tài)，但可以看到好轉(zhuǎn)趨勢[9]。與此同時，雖然去除了外源DHT，但與無處理小鼠比，處理小鼠具有血脂紊亂癥狀[9]。因為不同的報道描述DHT對血脂影響不同，但是不同的實驗使用了不同類型的樣本，如血清[9]、血漿[5]，因此需要補充樣本種類對實驗結(jié)果影響的相關(guān)研究。

3.4 心血管異常的分析目前僅見DHT處理大鼠相關(guān)的心血管疾病研究報道，而沒有使用DHEA、小鼠的案例。心血管疾病包括心臟疾病和血管疾病[1，16]。PCOS群體在表現(xiàn)高DHT雄激素血癥高發(fā)生率的情況下，PCOS患者更容易患心血管疾病[1]。例如PCOS群體中進行性心肌梗塞的發(fā)生率是健康群體的7倍[17]。

血管內(nèi)皮功能紊亂是心血管疾病常見癥狀，DHT處理大鼠有內(nèi)皮功能紊亂、血壓高和血管舒張壓增加的癥狀[17-18]。在結(jié)構(gòu)上，DHT處理大鼠血管彈性蛋白含量增加，被動血管腔直徑減小[16]。在功能上，DHT處理大鼠血管被動舒張壓降低，腸系膜動脈擴張活性降低，血壓增加40-50%[16]。高血壓反映出DHT處理大鼠血管對乙酰膽堿(acetyl choline，ACh)反應(yīng)活性降低[16，18]。雖然DHT處理大鼠血管對ACh的敏感性沒有變化，但是ACh誘導(dǎo)的血管舒張程度變小[16]。血DHT濃度與血管腔最大擴張有負相關(guān)關(guān)系，其它激素和體質(zhì)量與血管腔最大擴張沒有呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性。DHT引起的血管舒張降低部分源于血管收縮因子前列腺素的增加。因為使用前列腺合成酶COX抑制劑，或者前列腺素受體拮抗劑，可以恢復(fù)血管的正常功能[16]。同時，DHT也破壞了NO依賴型或非依賴型血管舒張，而且DHT還增加了血管對前列腺素誘導(dǎo)的血管收縮反應(yīng)活性[19]。

以上研究可以看出，DHT處理而成的雄激素化動物模型，心血管疾病研究集中在血管舒張、調(diào)節(jié)活性，而動脈粥樣硬化等病癥鮮有研究。由于高水平DHT可以誘導(dǎo)高脂血癥的發(fā)生，而高脂血癥是動脈粥樣硬化的重要風(fēng)險因素，因此存在DHT處理而成雄激素化動物模型具有發(fā)生動脈粥樣硬化的可能。需要補充開展相應(yīng)實驗內(nèi)容，以更全面的揭示該模型的心血管狀態(tài)，探索機制和調(diào)節(jié)途徑問題。

4 動物模型慢性炎癥的分析

DHEA、DHT處理嚙齒動物具有局部慢性炎癥反應(yīng)特征。大體表現(xiàn)為外周血中淋巴細胞、巨噬細胞數(shù)量增加，特定的炎癥因子如CRP、IL-6、TNF-α等濃度增加[20]，局部組織器官表現(xiàn)為巨噬細胞浸潤、天然免疫系統(tǒng)活躍、炎癥因子合成分泌增加。Kelly等最先報道了PCOS患者可能存在慢性炎癥。PCOS患者血液中具有更多的淋巴細胞、巨噬細胞，和更多的CRP、IL-6、TNF-α，這種特征在排除肥胖因素干擾后仍然存在，而且PCOS患者高發(fā)的糖尿病、動脈粥樣硬化等與慢性炎癥具有相關(guān)性。如TNF-α可以干擾胰島素下游分子的磷酸化，阻礙胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致胰島素抵抗，繼發(fā)糖尿病。CRP與LDL形成的復(fù)合物會激活補體系統(tǒng)誘導(dǎo)泡沫細胞，促進動脈粥樣硬化。

DHEA誘導(dǎo)表現(xiàn)PCOS樣癥狀的小鼠炎癥反應(yīng)不明顯[21]。與沒有處理小鼠比，這些小鼠的血液炎癥因子IFN-γ、TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-10、IL-12p70沒有明顯差異，并且內(nèi)臟脂肪組織的IL1β、TNF-α表達，和M1型巨噬細胞浸潤也沒有差異。但是不能排除其它組織存在局部炎癥反應(yīng)的可能。在DHEA誘導(dǎo)表現(xiàn)PCOS樣癥狀的大鼠，卵巢組織表現(xiàn)了炎癥反應(yīng)特征，如大部分囊性卵泡顆粒細胞層高表達炎癥相關(guān)分子VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1)、ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1)。此外，這些大鼠的腹膜腔免疫細胞在體外培養(yǎng)條件下炎癥因子合成分泌增加，這些炎癥因子為TNFa、IFN-γ、MCP-1、IL-6、IL-12P70、IL-10。DHEA促進了腹膜腔、卵巢組織中免疫細胞表達VCAM-1、ICAM-1配體ICAM-1、VLA-4和LFA-1。并且在體外條件下，DHEA也誘導(dǎo)了CD4+細胞等免疫細胞產(chǎn)生類似的反應(yīng)。

同為雄激素，均可經(jīng)AR發(fā)揮作用，DHT對炎癥反應(yīng)的誘導(dǎo)作用可能與DHEA類似[22]。目前沒有報道DHT處理大鼠、或小鼠血液免疫細胞、炎癥因子的變化。已有的數(shù)據(jù)顯示，DHT可以改變卵巢局部M1型巨噬細胞、M2型巨噬細胞的比例，DHT處理大鼠15 d，卵巢有腔卵泡、排卵前卵泡中的巨噬細胞數(shù)量增加，M1/M2比例也增加，表現(xiàn)炎癥反應(yīng)活性，此時大鼠已有PCOS樣癥狀，如囊性卵泡。增加的M1型巨噬細胞一個可能作用是誘導(dǎo)顆粒細胞凋亡。在體外，1 μmol·L-1的DHT處理24 h，不會引起顆粒細胞的死亡，但是當(dāng)對顆粒細胞和巨噬細胞共培養(yǎng)體系進行相同處理時，顆粒細胞發(fā)生了明顯凋亡。是否M1還參與了其它PCOS樣癥狀的發(fā)生發(fā)展，還有待探索。DHT導(dǎo)致卵泡內(nèi)M1數(shù)量的增加可能是通過卵泡液中高濃度的chemerin實現(xiàn)的，M1型巨噬細胞表達chemerin的受體CMKLR1。體外實驗證明，chemerin可以誘導(dǎo)M1型巨噬細胞從低濃度向高濃度遷移。值得注意的是，DHT處理大鼠15 d，卵巢卵泡液中出現(xiàn)高濃度chemerin，而血液chemerin維持在正常水平。在DHT處理大鼠28 d時，卵泡液、血液均具有高濃度的chemerin。說明DHT誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在局部與外周具有相對獨立性。

局部的炎癥反應(yīng)可能在一段時間內(nèi)存在波動。DHT處理大鼠28 d，相對與15 d，巨噬細胞數(shù)量減少，M1/M2比例也減小。并且隨著M1型巨噬細胞表達CMKLR1增加，表達CMKLR1的M1巨噬細胞數(shù)量驟然減少[24]。我們的實驗數(shù)據(jù)顯示，DHT處理小鼠21 d表現(xiàn)血中性粒細胞比例增加，在35 d現(xiàn)象消失(數(shù)據(jù)未發(fā)表)。以上信息提示，因為波動的存在，對炎癥反應(yīng)水平的檢測應(yīng)有明確的檢測時間點。DHEA和DHT模型適用于慢性炎癥的研究。

5 動物模型生物節(jié)律紊亂的分析

僅有DHT處理小鼠具有生物節(jié)律紊亂的報道，而沒有DHEA、大鼠的相關(guān)報道。目前，研究者已經(jīng)確定DHT處理小鼠表現(xiàn)了雄激素依賴性的生理節(jié)律基因表達重編程，表現(xiàn)了不同組織器官普遍存在生物節(jié)律紊亂,過多的雄激素會導(dǎo)致不同組織器官間生物節(jié)律不匹配，具體表現(xiàn)如增加了組織依賴型的時相分布[23]。使用DHT處理小鼠，各種組織的Period 2(一種生物節(jié)律蛋白)發(fā)生不同變化，進而影響了各組織振蕩器的活性。體內(nèi)和體外實驗均顯示DHT可以通過雄激素受體直接改變生物節(jié)律基因表達模式，進而誘導(dǎo)內(nèi)源性的生物節(jié)律不匹配，這一過程便是雄激素依賴性的生理節(jié)律基因表達重編程。常見的生物節(jié)律紊亂疾病是睡眠紊亂，DHT可能適用于相關(guān)問題的研究。

6 總結(jié)和展望

嚙齒動物是常用的人類疾病動物模型，因為它的生命周期短，清晰的遺傳背景，成熟的基因編輯技術(shù)。DHEA或DHT誘導(dǎo)的高雄激素化動物已經(jīng)在很多研究中被使用，這類模型的建立機制是基于PCOS具有高雄激素血癥。實踐證明雄激素可以誘導(dǎo)多種癥狀，如囊性卵泡、慢性炎癥、胰島素抵抗、血管內(nèi)皮功能紊亂和肝脂肪變性等。這些癥狀在肥胖、糖尿病、高血壓等慢性疾病也多有表現(xiàn)。因此這類模型適用于慢性疾病的研究。與其它因素誘導(dǎo)的模型相比，DHEA或DHT動物模型有更高的成功率，表現(xiàn)癥狀更典型、多面等優(yōu)勢。此外，DHEA或DHT模型的局限性使其不能回答PCOS高雄激素血癥是怎樣發(fā)生的這類問題。而已發(fā)現(xiàn)的DHEA、DHT通過改變神經(jīng)系統(tǒng)活性、影響糖脂代謝、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激而引起不同癥 狀的具體機制還有待進一步驗證和完善。