肝星狀細胞糖脂蛋白質代謝：抗肝纖維化的新靶標

楊 婷，趙丹靂，周媛媛，王穎謙，李 洋，張 峰，鄭仕中

(南京中醫藥大學江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室，江蘇 南京 210023)

肝纖維化是慢性肝病發展為肝硬化的必經之路，肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)在其中扮演重要角色[1]。各種病因(如酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝、病毒性肝炎等)導致肝臟發生損傷時，靜息態的HSC活化并轉分化為促進瘢痕形成的肌成纖維細胞(myofibroblast，MFB)并分泌細胞外基質(ECM)促進損傷修復，但過度的ECM累積會導致肝臟纖維化，從而損害正常肝功能，誘發肝硬化，最終導致肝衰竭甚至死亡[1]。與癌細胞增殖過程相似，為滿足活化時產生的巨大能量需求，HSC發生了代謝重編程，因此抑制HSC的代謝可能是阻止HSC活化及肝纖維化發生發展的有效方法之一。近年來，越來越多的研究揭示了HSC的代謝重編程機制以及這一過程對肝臟疾病的影響。本文總結了HSC的糖代謝、脂質代謝和蛋白質代謝的最新研究成果，包括HSC活化時發生的Warburg效應、自噬相關的脂滴降解及脂質代謝增加，谷氨酰胺、蛋氨酸等代謝改變等，闡述了HSC活化時三大營養物質的代謝重編程過程及其潛在的應用，為肝纖維化等慢性肝病的治療提供了新思路。

1 糖代謝

葡萄糖代謝重編程在HSC活化過程中起重要作用，主要通過上調糖酵解以滿足活化的能量需求。糖酵解是指在無氧條件下，1分子葡萄糖被分解成為2分子丙酮酸并產生能量，隨后生成乳酸的過程。HSC的糖酵解受多種因素影響，如葡萄糖的轉運、葡萄糖的細胞內加工、乳酸的生成及一些其他因素如外泌體的分泌和表觀遺傳修飾等，抑制HSC糖酵解是抗肝纖維化有效策略之一。

葡萄糖的轉運是HSC糖代謝過程中ATP產生的限速步驟，葡萄糖轉運蛋白(GLUT)承擔了葡萄糖的轉運工作。研究發現活化的人HSC和培養激活的大鼠HSC葡萄糖利用率均提高[2]，且原代培養激活的大鼠HSC葡萄糖運輸能力和糖酵解均增強[3]。在原代培養激活或永生化的大鼠HSC中GLUT1[3]、GLUT2[4]和GLUT4[5]均有表達，并能受細胞外高葡萄糖[3]或嘌呤能信號的調節[5]。有研究發現，天然產物姜黃素能夠通過阻斷p38 MAPK信號通路阻止GLUT2的膜易位，與此同時刺激過氧化物酶體增殖物激活受體PPARγ的活性和谷胱甘肽的重新合成來抑制GLUT2的表達，進而抑制葡萄糖的運輸，產生抗肝纖維化作用[4]。

葡萄糖的細胞內加工是HSC糖酵解的另一關鍵過程，糖代謝關鍵酶在這一過程中發揮重要作用。在永生化的人或小鼠原代HSC活化過程中，己糖激酶2(HK2)、6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3(PFKFB3)和丙酮酸激酶(PK)的蛋白表達均增加[6]。PFKFB3主要功能為催化果糖-2，6-二磷酸的產生，果糖-2，6-二磷酸為關鍵酶磷酸果糖激酶1(PFK1)的別構激活劑，因此PFKFB3能夠間接促進糖酵解的發生。原代小鼠HSC及人HSC-LX2活化過程中，細胞質內多聚腺苷酸化元件結合蛋白4(CEBP4)與PFKFB3 mRNA的3’ UTR結合，催化其poly(A)尾的多聚腺苷酸化進而誘導其翻譯，促進糖酵解[6]。這些酶誘導的糖酵解增強還伴隨著糖異生相關基因的下調，包括磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(PCK1)和果糖二磷酸酶1(FBP1)[3]。丙酮酸激酶M2(PKM2)是糖酵解的另一限速酶，活化的HSC(activated HSC，aHSC)PKM2的表達增加，有氧糖酵解水平也隨之增加[7]。HSC的活化由二聚化的PKM2介導，天然產物紫草素對肝纖維化小鼠有較好的治療作用，能夠通過促進人HSC PKM2的四聚化來減弱其活性，從而降低胞內葡萄糖消耗和乳酸堆積；與此同時，四聚化的PKM2還通過調控組蛋白修飾直接降低HSC活化相關轉錄因子的表達，抑制HSC活化[7]。

糖酵解的終產物乳酸與HSC活化和MFB表型的維持有直接關系。aHSC內乳酸輸出泵單羧酸轉運蛋白4(MCT4)的表達上調，盡管如此，胞內乳酸水平仍然很高；阻斷乳酸在胞內的積累可抑制增殖，同時抑制MFB表型相關基因，誘導成脂基因的表達和脂質堆積[3]。抑制乳酸的生成是阻斷其在細胞內積累的有效策略之一，乳酸的生成由酸脫氫酶LDH-A催化，研究發現天然產物千層紙素A能通過抑制LDH-A逆轉人源HSC-LX2的活化[8]，其機制為通過影響糖酵解阻止細胞骨架形成及肌球輕鏈蛋白MLC2磷酸化，最終抑制細胞收縮，使MFB表型難以維持[8]。這一結果在體內也得到了驗證，千層紙素A治療降低了肝纖維化小鼠肝臟的高乳酸水平，緩解了肝纖維化[8]。

此外，一些其他因素同樣能誘導HSC發生葡萄糖代謝重編程，如外泌體的分泌及表觀遺傳修飾等。aHSC能夠分泌外泌體快速誘導糖酵解，有研究發現，在缺氧和炎癥條件下缺氧誘導因子1-α(HIF-1α)刺激HSC活化，并促進aHSC分泌含有GLUT1和PKM2的外泌體，誘導HSC的糖酵解，進一步促進HSC活化[9]。表觀遺傳修飾也會導致HSC葡萄糖代謝的改變，在體外培養的人HSC中，促纖維化細胞因子TGF-β1將DNA甲基轉移酶DNMT1和組蛋白甲基轉移酶G9a募集至染色質，使HSC糖酵解增強[10]。DNMT1和G9a聯合抑制劑CM-272能使缺氧和TGF-β1誘導活化的人HSC糖酵解率恢復到靜息水平[10]，對體外培養的人肝臟活體切片也無毒性，且有明顯抗纖維化作用，有望成為治療肝纖維化的有效藥物[10]。

aHSC中葡萄糖即使在有氧條件下也以糖酵解的代謝方式最終生成乳酸，而不是進入三羧酸循環完全氧化供能，即Warburg效應。葡萄糖的有氧氧化雖有較高的產能效率但其產能速率不及糖酵解，且糖酵解將中心碳代謝成乳酸供機體加工利用而非以CO2的形式完全釋放，Warburg效應的存在滿足了aHSC分泌ECM、增殖遷移的物質及能量需求。然而，雖然有大量研究證明了HSC活化過程中糖代謝的重要意義，但最新研究發現，靜息態的HSC(quiescent HSC，qHSC)與aHSC之間差異表達的代謝基因中只有6%涉及碳水化合物代謝，且盡管aHSC糖酵解基因表達和葡萄糖消耗均增加，剝奪葡萄糖后卻并沒有抗纖維化作用[11]，表明葡萄糖并不是HSC活化過程中唯一的能源物質。

2 脂質代謝

2.1 自噬與脂滴丟失健康肝臟中qHSC富含脂滴(lipid droplet，LD)，活化時LD丟失。脂肪特異性蛋白27(Fsp27)是LD形成過程中的關鍵蛋白，Fsp27過表達的原代大鼠HSC活化及增殖均被抑制，其機制可能是Fsp27維持了胞內LD從而使HSC保持在靜息狀態[12]。HSC活化時LD丟失過程可分為兩個階段[13]。第一階段，LD被分解成更小的單位，隨著細胞的增殖分裂重新分布到新生成的細胞中去。第二階段，LD逐漸變小；當HSC完全轉分化為MFB表型后，LD完全丟失[13]。

HSC活化過程中LD的丟失主要借助自噬來完成。自噬是一種細胞應激反應，參與大分子和細胞器的自溶酶體消化，是營養物質和能量的細胞內來源。自噬關鍵基因ATG7缺失的小鼠發生肝損傷后，HSC維持其靜息狀態且胞內LD也未丟失[14]。小檗堿能通過抑制自噬相關基因ATG5從而抑制HSC自噬，促進胞內LD積累，從而抑制人源HSC的活化及增殖，并抑制CCl4誘導的小鼠肝纖維化[15]。有研究者認為LD丟失時胞內視黃醇類物質的減少對HSC活化有重要意義，如脂多糖誘導HSC發生自噬后，胞內LD的丟失引發視黃酸信號功能障礙，進而下調TGF-β偽受體BAMBI，使HSC對TGF-β信號敏感，易于活化[16]；也有研究者持不同意見，認為LD成分水解后游離脂肪酸的釋放才是關鍵，這些釋放出來的脂肪酸會進入線粒體進行β氧化，為細胞活化提供“燃料”，如添加內源性油酸可以促進自噬缺陷的HSC活化，而這一現象在抑制脂肪酸β氧化后消失[16]。有趣的是，小鼠缺乏卵磷脂-視黃醇酰基轉移酶(LRAT)時，其HSC靜息狀態下也無LD存在，這種無LD的HSC不能自發活化，但是經誘導后依然可以完全活化[17]。這一結果與在其他模型中觀察到的HSC活化伴隨著LD丟失相矛盾，可能由于這些LRAT缺乏的HSC活化時利用了脂肪酸以外的其他能源物質。還有研究發現HSC自噬能夠通過抑制成纖維性細胞外囊泡的釋放減輕肝纖維化[18]，這一觀點與先前HSC自噬與活化呈正相關的觀點相矛盾，表明HSC自噬是把“雙刃劍”，其在肝纖維化中究竟扮演何種角色，未來還需進一步探究。

2.2 成脂基因與脂肪酸代謝qHSC主要功能為儲存脂肪，因此也稱“肝儲脂細胞”，成脂基因維持著qHSC中的脂質穩態。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)和甾醇調節元件結合蛋白-1(SREBP-1c)是兩個調控HSC成脂基因轉錄的主要因子，是HSC處于靜息狀態的標志，一旦活化就會丟失[19]。異位誘導PPAR-γ和SREBP-1c可以逆轉HSC活化[19]，表明成脂轉錄程序與各種轉錄因子共同維持著HSC的靜息狀態。

HSC脂肪酸代謝與HSC活化及肝纖維化的發生發展密切相關。HSC活化過程中脂肪酸的組成發生變化，在HSC活化早期，棕櫚酸、油酸、棕櫚油酸和硬脂酸這些主要脂肪酸的濃度達到峰值。隨著進一步活化，游離脂肪酸總量下降，而花生四烯酸(C20:4)和二十二碳六烯酸(C22:6)相對豐富，脂肪酸伸長酶(Elov15，Elov16)和去飽和酶(SCD1)上調[20]。線粒體內脂肪酸β氧化是HSC活化的重要能量來源，抑制β氧化能夠阻止HSC活化[21]，這一作用與抑制自噬產生的作用相類似，這進一步證實了自噬對HSC活化時LD丟失的重要作用[21]。乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)是一種調節脂肪酸β氧化和脂肪酸從頭生成(DNL)的酶，參與HSC活化過程中的代謝重編程。ACC抑制劑通過減少α-SMA的表達和膠原蛋白的產生抑制原代大鼠HSC活化[22]。DNL是HSC活化過程中誘導糖酵解和氧化磷酸化所必需的，ACC抑制劑通過抑制DNL阻止了原代大鼠HSC活化，且對飲食誘導的大鼠肝纖維化有治療作用，然而DNL調節HSC代謝的分子機制尚不清楚，ACC抑制劑在體內的抗纖維化作用也不完全歸因于其對HSC代謝的影響[22]。雖然其作用機制還未發掘完全，但ACC抑制劑已表現了出良好的抗肝纖維化作用，目前已有ACC抑制劑進入臨床研究，如firsocostat(GS-0976)。研究發現firsocostat聯合應用FXR激動劑cilofexor可通過調控患者肝臟的脂質代謝治療NASH引起的纖維化和肝硬化，且暫未發現明顯毒副作用[23]，具有較好的臨床應用前景。

3 蛋白質代謝

活化的HSC中ECM生成有極大的能量需求，這一需求除通過糖和脂肪的代謝重新編程外，還通過蛋白質代謝來滿足。有研究認為，細胞增殖過程中，蛋白質代謝可能比糖代謝更為重要，比較qHSC和aHSC之間差異表達的代謝基因發現，涉及碳水化合物代謝的基因僅占6%，而蛋白質代謝相關基因高達38%，其中又以谷氨酰胺代謝的差異最為顯著，蛋氨酸代謝也參與其中[11]。

谷氨酰胺分解是HSC活化時除Warburg效應外的另一代謝特征。谷氨酰胺分解過程中，谷氨酰胺首先在谷氨酰胺酶(GLS)催化下脫氨生成谷氨酸，接著轉化為α-酮戊二酸，并進入三羧酸循環代謝產能。HSC活化時Hedgehog-YAP信號通路的激活誘導了GLS1的表達以及谷氨酰胺的分解[11]，用通路抑制劑環多巴胺或維替泊芬處理活化的大鼠HSC后，細胞GLS1表達降低，活化水平也隨之降低，而這一現象在補充了谷氨酰胺代謝產物α-酮戊二酸后被逆轉[11]。在體內，HSC谷氨酰胺的分解標志著肝纖維化的發生，而剝奪谷氨酰胺能有效抑制HSC活化[24]，這種細胞特異性拮抗作用有望成為肝纖維化治療的新靶點。

蛋氨酸代謝也與HSC活化密切相關，但其作用并不是供能，而是代謝成S-腺苷蛋氨酸(SAM)影響機體的甲基化反應。蛋氨酸是人體正常生長發育所必需的氨基酸之一，飲食中的蛋氨酸在小腸吸收后被用于合成蛋白質或者在蛋氨酸腺苷轉移酶(MAT)催化下生成機體甲基的直接供體SAM。HSC的活化需要兩個MAT基因：MAT2A和MAT2B，MAT2B能夠激活促纖維化的ERK和PI3K等通路，而MAT2A能夠改變胞內SAM的水平，沉默這兩種基因能夠抑制HSC活化及細胞生長[25]。在HSC活化過程中，MATα2和MATβ蛋白的磷酸化增強，蛋白穩定性增加，有利于人HSC的轉分化[26]。瘦素主要由脂肪細胞產生，可通過激活原代小鼠HSC的β-catenin信號通路，減弱E2F-4與MAT2A啟動子的結合，從而增加MAT2A的活性[27]，降低患者血漿瘦素水平有望成為治療肥胖型肝纖維化患者的有效策略之一。目前針對HSC蛋氨酸代謝的研究尚處于起步階段，其對肝纖維化的影響還需進一步探究。

4 總結與展望

隨著研究的深入及“組學”技術(代謝組學、蛋白質組學和表觀基因組學)的廣泛應用，人們逐漸認識到HSC的異質性，這種異質性表現為擁有不同活化能力，或在再生、纖維化、癌癥和免疫調節等方面的作用各不相同的細胞表型，這些不同細胞表型的維持很大程度上借助了代謝調控。迄今為止通過調節HSC代謝治療NASH纖維化的療法十分有限，但也有一些已進入臨床研究，包括調節葡萄糖、脂質和膽汁酸代謝的FXR激動劑[28]、調節脂質和葡萄糖穩態的甲狀腺激素受體β激動劑[29]以及調控脂肪生成的PPAR激動劑[30]等。闡明HSC代謝過程有利于設計治療肝纖維化的新靶向干預方法，也為其他纖維化疾病的研究提供參考。目前針對HSC代謝的研究大多集中在體外細胞水平，未來仍需在動物體內進一步驗證這些研究成果，以期開發出更多可用于治療肝纖維化的有效藥物。