miR-155-5p通過靶向抑制Sirt1影響子癇前期發生的機制

曹丹 湯小芳 李敏慧

南京醫科大學附屬常州市第二人民醫院產科（江蘇常州213000）

子癇前期是一種妊娠中晚期潛在的多系統性疾病，它是引起圍產期孕婦早產、死產、死胎的重要病因，嚴重的威脅了5% ～14%孕婦的健康［1］。子癇前期特征是妊娠20 周后出現高血壓并伴有蛋白尿和其他系統性疾病，如腎衰竭，肝功能異常，子宮內生長受限，子宮胎盤功能不全等［2-3］。臨床治療過程中常伴有不良的妊娠結局，并且該病造成的嚴重并發癥對母嬰具有深遠的影響［4］。目前，子癇前期的發病機制尚未明確，研究［5］表明絨毛外滋養層細胞侵襲失調與子癇前期的發生密切相關。因此，深入探究子癇前期的發病機制，從而尋求新的治療手段具有重要意義。

MicroRNA（miRNA）是一類長度為22～25 個核苷酸的內源性非編碼單鏈小RNA，在生長發育、增殖、凋亡和炎癥、腫瘤及多種系統性疾病等生理病理過程起到調節作用。多種miRNAs 在子癇前期患者的妊娠胎盤組織中差異表達，其可能通過調控多種基因表達介導滋養細胞功能發生變化，從而在子癇前期的發生發展過程中發揮作用［6］。有研究者通過miRNA 表達譜分析發現miR-155-5p 在子癇前期患者胎盤組織中顯著失調，表明miR-155-5p可能在子癇前期中發揮至關重要的作用，有望成為子癇前期診斷和治療的標志物［7］。LEE 等［8］研究證實Sirt1 可能通過調節Akt/p38MAPK 信號通路參與絨毛外滋養層細胞侵襲和螺旋動脈重構，從而與胎盤發育有關。然而，目前關于miR-155-5p 與Sirt1 對子癇前期發病的影響和致病機制尚未明確。

因此，本研究通過檢測子癇前期患者胎盤組織中miR-155-5p 和Sirt1 的表達水平，首次探究miR-155-5p 和Sirt1 在子癇前期發病過程中的調控機制，旨在為子癇前期的發病機制研究和臨床治療提供新的思路和理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣本來源2018年1-12月期間，選擇本院婦產科收治的子癇前期患者和正常孕婦樣本各25 例。排除了患有雙胎妊娠、慢性高血壓、腎臟疾病、糖尿病、胎兒畸形和急性或慢性肝炎的患者。子癇前期診斷標準參考第九版《婦產科學》［9］，正常妊娠者和子癇前期患者的臨床資料為：對照組妊娠者年齡（27.2 ± 3.6）歲，BMI（25.9 ± 1.3）kg/m2，終止妊娠孕周（38.9±0.7）周，收縮壓（112.8±3.5）mmHg，舒張壓（73.8 ± 2.8）mmHg；子癇前期妊娠者年齡（28.9 ± 3.9）歲，BMI（26.2 ± 1.5）kg/m2，終止妊娠孕周（36.2 ± 0.4）周，收縮壓（158 ± 4.1）mmHg，舒張壓（105 ± 3.2）mmHg。兩組年齡、BMI 和妊娠孕周方面比較差異無統計學意義（P＞0.05）。兩組收縮壓和舒張壓比較差異有統計學意義（P＜0.05）。所有的患者都采用剖腹產的方式。子癇前期胎盤組織取自25 例患者，正常妊娠者的胎盤組織取自25 例孕周正常的妊娠者。本研究經本院倫理委員會批準同意，所有納入研究的個體均簽署書面知情同意書，本研究遵循《赫爾辛基宣言》。

1.2 主要試劑和儀器滋養層細胞系HTR-8/SVeno細胞（中國科學院細胞庫）；RPMI 1640 培養基和胎牛血清（美國Hyclone 公司）；總RNA 抽提Trizol 試劑（美國Life 科技公司）；LipofectamineTM2000（美國Invitrogen 公司）；miRNA-155-5p mimics 和miRNA-155-5p negative control（吉瑪生物技術有限公司）；SYBR qRT-PCR Super Mix（上海翌圣生物科技有限公司）；BCA 試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；Sirt1、GAPDH 和山羊抗兔二抗（中國賽默飛世爾科技有限公司）；細胞培養箱（蘇州凈化設備制造廠）；實時熒光定量PCR 儀（瑞士Roche公司）。

1.3 細胞培養與轉染滋養層細胞系HTR-8/SVeno培養在含有10%胎牛血清、100 μg/mL 鏈霉素和100 U/mL 青霉素的RPMI-1640 培養基中。置于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中進行培養。miR-155-5p mimics、Sirt1 siRNA 以及它們各自的陰性對照購自Gene Pharma（中國上海）。按照說明書，使用Lipofectamine 2000 試劑進行滋養層細胞轉染。轉染后不同分組細胞在37 ℃5% CO2條件下培養48 h，用于后續RNA 和蛋白相關檢測實驗。

1.4 RT-qPCR 分析用TRIzol 試劑提取胎盤組織和HTR-8/SVeno 細胞的總RNA。用Q5000（Quawell Technology，美國）測量提取的RNA 的濃度和純度。然后通過逆轉錄酶試劑獲得cDNA。 使用Light Cycler 96 儀器（Roche，巴塞爾，瑞士）進行實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）檢測miR-155-5p 和Sirt1 mRNA水平。取PCR上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板cDNA 1 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，RNase free water 7 μL 配置成總體積為20 μL 的反應體系。使用實時熒光定量PCR 儀進行PCR 擴增，兩步法程序為：94 ℃2 min（預變性），94 ℃10 s（變性）、60 ℃30 s（退火）、72 ℃30 s（延伸），共35個循環。qPCR 中使用的引物見表1。 通過2-ΔΔCt比較方法檢測的miR-155-5p 和Sirt1 mRNA 相對表達水平。

表1 RT-qPCR 中使用的引物序列Tab.1 Primer sequences used in RT-qPCR

1.5 傷口愈合實驗將轉染后的HTR-8/SVeno 細胞用胰蛋白酶消化后重懸，稀釋至細胞濃度為5×105個/mL，吸取1 mL接種于6孔板中，放置在37 ℃培養箱中繼續培養。待細胞長滿后，用無菌的10 μL槍頭在6 孔板中央輕輕劃過，接著用滅菌的PBS 清洗細胞，加入2 mL 無血清培養基，放入培養箱中繼續培養。在0、24 h 時分別用光學顯微鏡下進行觀察并拍照。

1.6 Transwell檢測細胞侵襲將轉染后的HTR-8/SVeno 細胞用胰酶消化，加入無血清的RPMI 1640培養基制備成濃度為3×105個/mL 的細胞懸液，吸取200 μL 細胞懸液加入Transwell 上室，下室每孔加入600 μL 含10% FBS 的RPMI 1640 培養基，放入37 ℃5% CO2細胞培養箱中繼續培養24 h。取出Transwell 小室，用棉簽擦去上層未遷移的細胞，滅菌的PBS 清洗三次，4%多聚甲醛固定20 min，結晶紫染色15 min。顯微鏡下觀察，每孔隨機選取5 個視野拍照并計數，這些視野中細胞的平均值為Transwell 小室細胞遷徙的細胞數目。

1.7 Western blot 檢測用RIPA 裂解液提取胎盤組織和HTR-8/SVeno 細胞的總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品與6×SDS 蛋白上樣緩沖液混勻后煮沸10 min。取變性蛋白40 μg/每孔上樣至10%SDS-PAGE 凝膠中進行電泳分離蛋白，將分離的蛋白樣品200 mA 恒流電轉至PVDF 膜上。轉膜后，將PVDF 膜放入含5%脫脂奶粉的封閉液中封閉2 h，接著加入稀釋好的Sirt1、MMP-2、MMP-9、GAPDH（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過夜。用TBST 洗膜3 次，每次10 min。隨后，加入稀釋的山羊抗兔二抗（1∶2 000）室溫下孵育1 h。再次用TBST 洗膜3次，按照ECL試劑盒說明書配制發光液，加ECL 發光液將PVDF 膜均勻覆蓋，用Bio-Rad 成像儀顯影，Image J 軟件分析條帶的灰度值，以GADPH 為內參進行定量的分析。

1.8 統計學方法采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析，所有實驗均重復3 次，所有數據均以均值±標準差表示，組間差異采用單因素方差分析并進行t檢驗。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 子癇前期患者胎盤組織中miR-155-5p及Sirt1的表達通過RT-qPCR 檢測胎盤組織中miR-155-5p 和Sirt1 mRNA 水平，結果表明與正常患者相比，子癇前期患者的胎盤中miR-155-5p 的表達水平顯著增加（圖1A），而Sirt1 mRNA 水平明顯降低（圖1B），見表2 。子癇前期患者中miR-155-5p 和Sirt1 mRNA呈負相關（r=-0.636 6，P=0.016 9），見圖1C。進一步進行蛋白質免疫印跡實驗，結果顯示，與正常組相比，子癇前期組中Sirt1 蛋白水平降低（P＜0.01），見圖1D。

圖1 miR-155-5p 和Sirt1 在子癇前期患者胎盤組織中的變化Fig.1 Changes of miR-155-5p and Sirt1 in placenta tissue of patients with pre-eclampsia

表2 樣本miR-155-5p 和Sirt1 mRNA 表達比較Tab.2 Comparison of miR-155-5p and Sirt1 mRNA expression in samples ±s

表2 樣本miR-155-5p 和Sirt1 mRNA 表達比較Tab.2 Comparison of miR-155-5p and Sirt1 mRNA expression in samples ±s

組別對照子癇前期t 值P 值miR-155-5p 0.88±0.09 3.14±0.19 10.49＜0.000 1 Sirt1mRNA 0.69±0.04 0.36±0.03 6.89＜0.000 1

2.2 miR-155-5p 抑制Sirt1 的表達通過miR-155-5p 轉染HTR-8/SVneo 細胞，然后采用RT-qPCR 檢測miR-155-5p 的表達水平。miR-155-5p mimics 組中miR-155-5p表達水平比miR-155-5p mimics NC組中顯著升高（圖2A）。見表3。另外，通過RT-qPCR和Western blot 檢測Sirt1 的mRNA 和蛋白在miR-155-5p 過表達模型中的表達情況。結果顯示，Sirt1 mRNA 水平在miR-155-5p mimics 組中明顯低于mimics NC 組（圖2B），見表3，并且Sirt1 的Western blot 結果與它的mRNA 變化趨勢一致。另外，相對于mimics NC 組，MMP-2 和MMP-9 的表達 在miR-155-5p mimics 組中顯著增加（圖2C、D）。見表4。

圖2 在HTR-8/SVneo 細胞中過表達miR-155-5p 對Sirt1 的影響Fig.2 Effects of over-expression of miR-155-5p on Sirt1 in HTR-8/SVneo cells

表3 miR-155-5p mimics 轉染效率檢測Tab.3 Detection of miR-155-5p mimics transfection efficiency±s

表3 miR-155-5p mimics 轉染效率檢測Tab.3 Detection of miR-155-5p mimics transfection efficiency±s

組別miR-155-5pSirt1 mRNA mimics NC1.06±0.091.02±0.05 mimics t 值P 值3.25±0.14 12.83＜0.001 0.51±0.05 7.16 0.002

表4 蛋白免疫印跡分析Sirt、MMP-2和MMP-9蛋白的表達Tab.4 Western blot analysis of Sirt，MMP-2 and MMP-9 protein expression ±s

表4 蛋白免疫印跡分析Sirt、MMP-2和MMP-9蛋白的表達Tab.4 Western blot analysis of Sirt，MMP-2 and MMP-9 protein expression ±s

組別Sirt1MMP-2MMP-9 mimics NC0.62±0.090.28±0.020.22±0.03 mimics t 值P 值0.42±0.0.05 3.57 0.020 0.38±0.02 2.83 0.047 0.31±0.05 2.82 0.048

2.3 miR-155-5p 抑制滋養層細胞侵襲和遷移為了進一步闡明miR-155-5p 在滋養細胞中的功能，通過Transwell 侵襲試驗確定miR-155-5p 對滋養層細胞侵襲的影響，mimics NC 組單位面積滋養細胞的侵襲數量（41.85 ± 5.41）個，而miR-155-5p mimics 組的侵襲細胞數目為（18.84 ± 1.54）個，顯著高于mimics NC 組（P＜0.01），見圖3A。通過傷口愈合試驗測定miR-155-5p 對滋養層細胞遷移的影響，24 h 后mimics NC 組細胞劃痕閉合率為0 h 的（80.64 ± 6.68）%，mimics 組為（20.08 ± 1.25）%，顯著低于mimics NC 組（P＜0.01），見圖3B。以上結果說明miR-155-5p 的過表達顯著抑制滋養層細胞的侵襲和遷移能力。

圖3 miR-155-5p 抑制滋養層細胞侵襲和遷移Fig.3 miR-155-5p inhibits trophoblast cell invasion and migration

2.4 敲除Sirt1抑制滋養層細胞侵襲和遷移為了進一步驗證Sirt1對滋養層細胞侵襲和遷移的影響，使用Sirt1 siRNA 敲除Sirt1 的表達。通過RT-qPCR和Western blot 檢測Sirt1 敲除效率表明siRNA NC組中Sirt1 mRNA 的相對水平為（1.12 ± 0.14），siRNA Sirt1 組為（0.32 ± 0.08），遠低于siRNA NC 組（P＜0.01，圖4A）；siRNA Sirt1 同樣地抑制Sirt1 蛋白的表達（圖4B）。通過Transwell 侵襲實驗和傷口愈合實驗發現，siRNA NC 組單位面積內侵襲細胞數目為（52.82 ± 4.16）個，siRNA Sirt1 組為（24.65±2.24）個，顯著低于siRNA NC 組（P＜0.01，圖4C）；siRNA NC組傷口閉合率為（78.82±6.16）%，siRNA sirt1 組傷口閉合率為（30.92±2.56）%，遠低于siRNA NC 組（P＜0.01，圖4D）。上述結果表明敲除Sirt1 顯著降低滋養細胞的侵襲和遷移能力。

3 討論

子癇前期屬于妊娠期高血壓疾病的一種，是妊娠期特有的疾病，嚴重影響母嬰安全［10］，其發病機制尚未明確，但近幾十年來其發病機制研究已經取得了很大進展。目前，多數研究結果表明子癇前期的發生與滋養細胞侵襲異常、內皮細胞功能障礙、血管生成失衡等過程密切相關［11］。其中，絨毛外滋養層細胞侵襲失調會導致子癇前期的發生［8］。正常情況下，子宮胎盤動脈被血管內滋養細胞侵襲，并重塑成擴張的，無彈性的管，而不受母體的血管舒縮控制。但是滋養細胞侵襲失調時會出現重構障礙與維持高子宮胎盤血管阻力和宮內生長受限，這些與子癇前期有關［12-13］。本研究站在滋養細胞異常侵襲的角度，闡述失調的miR-155-5p 調控滋養細胞侵襲、遷移的潛在機制。

圖4 敲除Sirt1 抑制滋養層細胞侵襲和遷移Fig.4 Knockdown Sirt1 inhibits trophoblast cell invasion and migration

有研究對子癇前期患者的胎盤和血清的miRNA 進行高通量測序分析，鑒定出多種差異化表達的miRNA（miR-155、miR-210、miR-1233、miR-520），推測這些異常表達的miRNA 可能通過調控多種靶基因的表達，破壞胎盤的正常發育及其功能，參與子癇前期的發病［7，14-15］。miR-155 在子癇前期患者的胎盤和血清中均表達下降［7］，其有望作為子癇前期的預后和診斷的潛在標志物。本研究通過RT-qPCR 檢測子癇前期患者胎盤組織，發現子癇前期患者中miR-155-5p 表達顯著升高。有研究［16-17］證實，在B 細胞發育過程中，miR-155 靶向Sirt1 參與B 細胞惡性腫瘤的發生。而且，miR-155 參與調控多種癌癥的上皮-間充質轉化、侵襲和轉移［18-19］。然而，在子癇前期中miR-155-5p 與Sirt1 的聯系少有報道。本研究通過RT-qPCR 證實，子癇前期患者胎盤中miR-155-5p 表達顯著升高而Sirt1 降低，表明miR-155-5p 與Sirt1 可能參與子癇前期的發病過程。而且本研究結果顯示miR-155-5p 的表達與Sirt1 表達呈負相關，提示子癇前期患者體內較高水平的miR-155-5p 可能調控Sirt1 的表達參與子癇前期的發生。

滋養層細胞侵襲受到多樣途徑和多種因子調節，其中沉默信息調節因子1（Sirt1）參與調控過程。Sirt1 是NAD+依賴的蛋白質脫乙酰酶家族和營養傳感器的成員。 Sirt1 最初在萌芽的釀酒酵母中發現，是一種能夠調節壽命的基因，首先被鑒定為組蛋白脫乙酰基酶，促進染色質緊實并因此在營養缺乏時沉默基因組［20］。到目前為止，已經研究證實了該組蛋白脫乙酰基酶的許多非組蛋白靶標，包括p53、FOXO1 和PPARγ［21］。值得注意的是，Sirt1 被報道參與調節細胞增殖、凋亡、自噬和炎癥等生理活動［22-23］。有研究［24］發現Sirt1 缺乏都會導致Epcam +滋養層祖細胞的積累。本研究發現過表達miR-155-5p 可以降低Sirt1、MMP2 和MMP9 蛋白表達，抑制滋養層細胞遷移和侵襲。當敲除Sirt1 時，滋養層細胞遷移和侵襲的能力同樣地被抑制。這表明Sirt1 與滋養層細胞侵襲密切相關。

本研究僅初步探討了miR-155-5p 對滋養層細胞遷移和侵襲的作用機制，不足之處在于研究局限于細胞水平，而未進行體內實驗。本課題組在下一步的研究中會探究miR-155-5p 在小鼠子癇前期模型上的調控作用，為miR-155-5p 參與調控子癇前期的發病機制提供更有力的證據。綜上所述，在子癇前期患者胎盤組織中miR-155-5p 表達升高和Sirt1 表達降低可能與子癇前期發病相關，miR-155-5p 可能通過抑制Sirt1 表達調節滋養層細胞的遷移和侵襲從而影響子癇前期的發病進程。另外，子癇前期患者胎盤組織中高表達的miR-155-5p 可作為子癇前期的預后和診斷的潛在標志物，而Sirt1 可能成為子癇前期的治療靶點。