不同手術時機高血壓腦出血患者外周血及腦組織TGF-β1、NF-κB表達的差異

崔植野 李湖廣

高血壓腦出血是臨床上常見的腦血管疾病，與腦內動靜脈病變破裂出血相關，具有較高的致殘率和致死率[1]。近年來，高血壓腦出血發病率和病死率呈升高趨勢，嚴重影響患者生活質量[1-2]。在治療方面，臨床上常采用開顱血腫清除術且有一定的治療效果。研究表明，手術干預時機可能會影響手術效果及預后，目前關于手術時機尚無統一的觀點[3-4]。轉化生長因子-β1（transforming growth factor 1,TGF-β1）、NF-κB 是評估炎癥相關疾病嚴重程度及預后的重要指標[5]。研究表明，下調TGF-β1 mRNA表達可抑制腦微血管內皮細胞的凋亡，改善缺氧損傷[6]。而抑制NF-κB表達可減輕腦出血后的細胞凋亡，保護腦神經[7]；另一方面，高血壓腦出血后不同時期NF-κB表達具有時相性，但NF-κB在出血過程中的作用并不明確[8]。因此，本研究探討了不同手術時機高血壓腦出血患者外周血及腦組織TGF-β1、NF-κB的表達，以期為該病手術治療時機的選擇提供參考，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2013年4月至2017年8月在上海市浦東新區周浦醫院經頭顱CT影像學檢查且符合全國第四屆腦血管病學術會議相關診斷標準的高血壓腦出血患者245例，其中手術時機為超早期（出血后＜8 h）105例、早期（出血后8～24 h）95例、延遲（出血后＞24 h）45 例。3 組患者性別、年齡、BMI、高血壓病史、收縮壓、舒張壓、飲酒史、吸煙史、腦出血量、術前格拉斯哥昏迷評分（GCS）、手術方式等臨床資料比較，差異均無統計學意義（均 P＞0.05），見表 1。納入標準：（1）符合高血壓腦出血的診斷標準：血壓控制不滿意，未使用抗高血壓時的收縮壓140 mmHg、舒張壓90 mmHg，腦壓增高，Babinski征陽性；（2）首次發生腦出血；（3）發病時間72 h內；（4）2個月內未服用過激素或免疫抑制劑等藥物。排除外傷性腦出血、靜脈畸形腦出血、動脈瘤、腦疝及腫瘤破裂腦出血患者。本研究經醫院醫學倫理委員會審查通過，所有患者或家屬簽署知情同意書。

表1 3組患者臨床資料比較

1.2 方法

1.2.1 手術方法 （1）小骨窗開顱血腫清除術：患者全麻下，在最靠近血腫的顱骨處作5 cm左右的切口，使用電鉆張開一個半徑約2.0 cm的圓形骨窗，穿刺，沿穿刺針清除血腫，縫合切口。（2）微創血腫清除術：患者局麻下，穿刺針沿著電鉆進入顱骨，穿透后取電鉆，在血腫位進行引流，利用注射器清除血腫，拔出穿刺針。（3）開顱血腫清除術：患者全麻下行去骨瓣血腫清除術，取足夠大的骨瓣，打開硬腦膜，自顳中回切開作一個約1.5 cm的入口，深入血腫并清除血腫，電凝止血，修補硬腦膜，縫合。

1.2.2 外周血和腦組織取材方法 確診后立即取患者外周血5 ml。患者入手術室麻醉后，切開頭皮，止血后分離皮瓣，顯露骨窗，留取少量出血皮質區腦組織作為出血區標本，留取清除血腫旁約1 cm的周圍腦組織為非出血區標本。

1.2.3 外周血及腦組織TGF-β1、NF-κB mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。取0.5 ml外周血或0.1 mg腦組織（其中腦組織置于勻漿器中），加入1 ml Trizol試劑，使用氯仿、異丙醇法提取總RNA，使用紫外分光光度計測定總RNA濃度，A260/A280為1.8～2.0。按RT-PCR試劑盒（貨號：K1622，加拿大Fermentas公司）說明書進行操作，將RNA逆轉錄為cDNA。引物由上海生工生物技術有限公司合成，各引物序列見表2。RT-PCR反應條件：94℃預變性30 min；94℃變性15 min，60℃退火15 min，72℃延伸10 s，共40個循環。以-actin為內參，采用 2-ΔΔCt法計算 TGF-β1、NF-κB mRNA 相對表達量。

表2 各引物序列

1.2.4 腦組織TGF-β1、NF-κB蛋白表達檢測 （1）定性檢測：采用免疫組化Envision二步法。取部分腦組織標本，制備石蠟切片，脫蠟至水，3% H2O2室溫孵育10 min；PBS 沖洗，滴加抗大鼠 CD34（1∶200，批號：bs-0646R，北京博奧森生物技術公司）、兔抗人TGF-β1抗體（1∶200，批號：JM-4342-5，海浩洋生物科技有限公司）、兔抗人NF-κB 抗體（1∶200，一抗，批號：sc-10791，海浩洋生物科技有限公司），室溫過夜；PBS沖洗，滴加生物素標記的二抗（1∶400，批號：PL03b0371R，海浩洋生物科技有限公司），室溫孵育30 min；PBS沖洗，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素；PBS沖洗，二氨基聯苯胺（DAB）顯色。在CX23型顯微鏡（日本OLYMPUS）下觀察，以細胞核或細胞質內有棕黃色顆粒為陽性細胞。（2）定量檢測：采用Western blot法。采用RIPA蛋白裂解液法提取腦組織總蛋白，考馬斯亮藍法測定腦組織的蛋白質。取核蛋白樣品加入等體積的電泳樣品緩沖液加熱變性，取20 g蛋白上樣泳道，電泳后，轉移至硝酸纖維膜，采用5%脫脂奶粉封閉，遞次地加入NF-κB抗體（1∶300，鼠抗人，批號：8242，美國 Cell Signaling公司）/TGF-β1抗體（1∶300，鼠抗人，批號：RS-0103R，上海研晶實業科技有限公司）的一抗和辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶4 000，羊抗鼠，批號：7056，美國 Cell Signaling公司），以 DAB顯色，采用Gel Doc XR+型凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）定量掃描灰度值，以TGF-β1/甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、NF-κB/GAPDH 分別表示 TGF-β1、NF-κB的蛋白相對表達量。

1.3 術后并發癥統計 觀察并記錄3組患者術后消化道出血、肺部感染和顱內感染等并發癥發生情況。

1.4 統計學處理 采用SPSS 15.0統計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組患者外周血TGF-β1、NF-κB mRNA相對表達量比較 3組患者外周血TGF-β1、NF-κB mRNA相對表達量比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；其中超早期組外周血TGF-β1、NF-κB mRNA相對表達量最低，早期組其次，延遲組最高（均P＜0.05），見表3。

表3 3組患者外周血TGF-β1、NF-κB mRNA相對表達量比較

2.2 3組患者腦組織TGF-β1、NF-κB mRNA相對表達量比較 3組患者腦組織TGF-β1、NF-κB mRNA相對表達量比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；其中超早期組腦組織TGF-β1、NF-κB mRNA相對表達量最低，早期組其次，延遲組最高（均P＜0.05），見表4。

表4 3組患者腦組織TGF-β1、NF-κB mRNA相對表達量比較

2.3 3組患者出血區和非出血區腦組織TGF-β1、NF-κB蛋白相對表達量比較 3組患者腦組織出血區和非出血區TGF-β1、NF-κB蛋白相對表達量比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；其中超早期組腦組織出血區和非出血區TGF-β1、NF-κB蛋白相對表達量最低，早期組其次，延遲組最高（均P＜0.05），見表5。

表5 3組患者腦組織TGF-β1、NF-κB蛋白相對表達量比較

2.4 3組患者術后并發癥發生率比較 3組患者術后發生了不同程度的消化道出血、肺部感染和顱內感染，合計并發癥發生率比較差異有統計學意義（P＜0.05）；其中超早期組最低，早期組其次，延遲組最高（均P＜0.05），見表 6。

表6 3組患者術后并發癥發生率比較[例（%）]

3 討論

TGF-β1是具有調節細胞生長和分化作用的細胞因子，在細胞增殖、細胞分化、細胞外基質的代謝調節、細胞表型的調節以及淋巴細胞分化、免疫活性細胞增殖、細胞因子產生等過程中發揮著重要作用[9-10]。在急性腦血管疾病中，TGF-β1通過調節免疫炎癥、促進血管生成、抗凋亡、保護神經、修復損傷等途徑發揮腦保護的效果[11-12]。當周圍神經發生損傷時，TGF-β1表達明顯升高，其保護神經的作用主要有以下3點：（1）促進施萬細胞增殖、分裂，而施萬細胞具有清除、吞噬髓鞘及軸突的潰變殘余物及碎屑的作用；（2）誘導巨噬細胞滲出血管，穿過神經內膜，進入損傷神經處，協助施萬細胞清除碎屑；（3）髓神經纖維的髓鞘是由神經膜細胞包繞神經元軸突而形成的，有助于增強神經纖維信息傳遞。TGF-β1降低纖溶酶原啟動劑的活性，增加纖溶酶原啟動劑抑制劑-1的活性，從而抑制細胞外基質的降解；也可直接增加細胞外基質成分的合成速度，但細胞外基質積聚過多會導致瘢痕生成，抑制髓神經生長，故TGF-β1過高表達也可能對患者預后產生負面影響[13]。

NF-κB在多種細胞中表達，在炎癥、細胞凋亡及免疫調節等多種病理、生理過程中發揮作用，NF-κB的異常活化參與多種疾病的發生、發展及轉歸過程。一方面，NF-κB的適當啟動會使機體發生免疫反應，對感染產生應答，刺激膜細胞異常增殖并分泌大量炎癥因子，啟動的單核巨噬系統亦可發揮炎癥效應，增強細胞內的氧化應激水平，起到一定的保護作用[14-16]；另一方面，NF-κB無限制地被啟動，大大增強的炎癥反應也會促進炎癥細胞凋亡，使得免疫細胞“沉默”，降低機體對細菌感染的抵抗力，同時NF-κB還會刺激神經元和內皮細胞釋放細胞因子，增強巨噬細胞的滲入，巨噬細胞表達上調又反饋性刺激細胞因子分泌，大量細胞因子可氧化損傷神經元，遏制神經元再生[17]。

王恒等[8]認為高血壓腦出血后不同時期的NF-κB表達具有時相性，出血后1 h NF-κB開始表達，24 h達到高峰，持續至72 h降低，但該結果基于大鼠研究，與人類結果可能存在差異。本研究探討了不同手術時機高血壓腦出血患者外周血及腦組織TGF-β1和NF-κB表達，結果顯示手術時機推遲，患者外周血及腦組織TGF-β1、NF-κB蛋白及mRNA相對表達量明顯升高。筆者分析原因可能是腦組織損傷后，機體迅速啟動保護機制，腦組織局部TGF-β1、NF-κB表達上調；隨著外周血炎癥反應增強，TGF-β1、NF-κB又可通過損傷的血-腦脊液屏障進入血腫周邊，外周血TGF-β1、NF-κB表達也隨之升高，這可能是造成術后并發癥的病理原因[18-19]，與相關文獻報道結果類似[20-22]。

綜上所述，高血壓腦出血患者外周血及腦組織TGF-β1、NF-κB表達可隨手術時機推遲而明顯升高，術后并發癥發生率也明顯升高，建議對有手術指征的患者早期進行手術。