局部進展期直腸癌PARP-1表達與臨床轉歸的關系

謝旭赟 錢莉文 劉海 孫曉南

術前放化療聯合全直腸系膜切除術是局部進展期直腸癌的標準治療手段，雖然能降低腫瘤局部復發的風險[1-2]，但仍有22%的患者5年內發生局部復發或遠處轉移。早期識別局部進展期直腸癌患者的臨床轉歸，有助于發現高危患者并采取積極的治療措施，改善臨床預后。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1[poly（ADP-ribose）polymerase-1,PARP-1]是一類存在于多數真核細胞中具有重要生理功能的蛋白質翻譯后修飾酶，主要定位于細胞核內，少量存在于細胞質內[3]。當細胞核DNA損傷或形成缺口時，PARP-1激活，而活化的PARP-1識別并結合DNA缺口，形成同型二聚體，催化尼克酰二核苷酸（NAD+）降解為煙酸和腺苷二磷酸（ADP），通過對受體蛋白的聚腺苷二磷酸糖基化的修飾作用及自身修飾和聚腺苷二磷酸糖基水解酶的作用，傳遞細胞受損程度，啟動DNA修復系統，從而有效地修復DNA損傷[4]。在多種腫瘤中，PARP-1高表達提示患者預后較差。因此，本文就局部進展期直腸癌PARP-1表達與臨床轉歸的關系作一探討，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2008年1月至2012年11月浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院收治的中低位局部進展期直腸癌患者50例，其中男35例，女15例；年齡61（43，80）歲；腫瘤位置：中位 20例，低位 30例；癌胚抗原≥5μg/L 23例，＜5μg/L 27例；放療劑量 46.0（43.2，50.0）Gy；單藥化療 6 例，雙藥化療 42 例；術前新輔助放化療結束至手術時間8（4，12）周；術前新輔助放化療結束至手術期間化療周期：0個周期4例，1個周期30例，2個周期15例，3個周期1例；術后病理完全反應10例，無病理完全反應40例。納入標準：（1）經腸鏡病理檢查確診為直腸癌；（2）盆腔增強MRI檢查及全身評估檢查提示局部進展期且無遠處轉移；（3）接受術前新輔助放化療+全直腸系膜切除術+術后輔助化療。

1.2 隨訪情況 術后采取電話及門診復查的隨訪方式，術后前3個月每月1次，之后每3個月1次隨訪患者的一般情況、副反應等，完善血常規、腫瘤標志物及盆腔MRI、胸部+上腹部CT等檢查。截至2017年12月31日，中位隨訪時間為47.85個月。

1.3 PARP-1表達檢測 采用免疫組化SP染色法。取患者治療前腸鏡活檢腫瘤組織標本，脫水后用石蠟包埋制成切片（4μm厚），采用SP法檢測PARP-1的表達水平，按照試劑盒說明書進行操作。由1位經驗豐富的病理科醫生在光鏡下觀察，每個視野計數100個腫瘤細胞，每張切片觀察5個視野。細胞核內出現棕黃色顆粒的細胞即陽性細胞，陽性細胞占比=5個視野陽性細胞計數總和/500×100%，若＞60%為高表達，≤60%為低表達。單克隆抗體PARP-1購自美國Cell Signaling Technology公司，以陽性切片為對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4 統計學處理 采用SPSS 21.0統計軟件。Kaplan-Meier法繪制生存曲線并計算生存率，組間比較采用log-rank檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 總體生存復發情況 50例患者中，13例發生轉移復發，轉移復發率為26.0%。中位無病生存期為46.75個月，1、3、5 年無病生存率分別為 94.0%、78.5%、62.1%，見圖 1a；1、3、5年總體生存率為 98.0%、93.5%、90.6%，見圖 1b。

圖1 局部進展期直腸癌患者的生存曲線（a：無病生存率；b：總體生存率）

2.2 PARP-1表達檢測結果 50例患者治療前腫瘤組織中PARP-1高表達24例，見圖2a；低表達26例，見圖2b。

圖2 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1（PARP-1）高、低表達的免疫組化SP染色結果（a：高表達，陽性細胞占比＞90%；b：低表達，陽性細胞占比30%；×40）

2.3 PARP-1高、低表達患者術后轉移復發及生存情況術后隨訪期間，PARP-1高表達組發生轉移復發11例（22.0%），低表達組發生轉移復發2例（4.0%），兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；高、低表達組 1、2、3、4年無病生存率分別為87.5%、64.5%、55.3%、50.2%和100%、98.0%、98.0%、98.0%，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖 3。

圖3 聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1（PARP-1）高、低表達患者的生存曲線

3 討論

直腸癌是常見的惡性腫瘤，發病率很高[5]。隨著直腸癌治療方法的不斷深入研究，術前放化療聯合全直腸系膜切除術已成為標準治療手段，且較單純手術治療的生存獲益更好[6]。另有Meta分析結果顯示，直腸癌尤其是DUCKSⅡ、Ⅲ期患者，術前放化療聯合根治性切除術后復發率較直接手術治療更低[7-8]。然而，在臨床實踐中發現，直腸癌術前放化療的效果個體差異較大，腫瘤對放化療的反應從完全緩解到完全抵抗均有存在。因此，尋找術前放化療敏感性相關因素或靈敏的預測指標等，有助于指導直腸癌患者個體化治療方案的選擇，提高療效，避免無效或過度治療。

放療引起的DNA損傷修復幾乎在所有腫瘤細胞株中均可被發現，且與臨床放射敏感性相關。也就是說，較難被治愈的腫瘤常常表現出較強的DNA損傷修復能力。2015年，托馬斯·林達爾提出了“堿基切除修復”機制，現已成為DNA損傷修復機制的共識。PARP密切參與DNA單鏈損傷（SSB）和雙鏈損傷（DSB）的堿基切除修復，其中PARP-1占聚腺苷二磷酸糖聚合酶家族中酶活性的90%以上[9]，因此筆者推測PARP-1有望成為評估直腸癌患者臨床預后的生物標志物。當DNA發生斷裂損傷時，PARP-1上的鋅指結構會直接結合到SSB進行DNA缺口的識別，并通過鋅Ⅲ活化形成同型二聚體。從而催化NAD+降解為煙酸和ADP，再以ADP為底物在受體蛋白上合成蛋白酶激活受體，調整其構象、穩定性和活性[10]。另一方面，PARP-1自帶大量負電荷，又可招募并活化相關修復蛋白，如X線修復交叉互補組合-1（XRCC1）、DNA連接酶Ⅲ和 DNA聚合酶β，從而參與到DSB修復過程中[11]。Mazzotta等[12]采用免疫組化法檢測114例乳腺癌患者PARP-1和乳腺癌易感基因1（BRCA1）蛋白的表達，結果發現PARP-1高表達與無病生存期和總生存期相關，可作為乳腺癌患者的獨立預后因素。Xie等[13]采用免疫組化法檢測111例術后接受鉑類藥物輔助化療的非小細胞肺癌患者核苷酸剪切修復交叉互補基因1（ERCC1）、Muts同種組織蛋白2（MSH2）和PARP-1表達，結果發現ERCC1和PARP-1陰性患者較ERCC1或PARP-1陽性患者的總生存期明顯延長，差異均有統計學意義。Liu等[14]對564例胃癌患者腫瘤組織中PAPR-1表達進行免疫組化檢測，結果發現胃癌組織中PARP-1高表達與幽門螺桿菌感染、腫瘤分化差、腫瘤浸潤深、淋巴結轉移等密切相關；PARP-1高表達患者總生存率及無病生存率明顯降低；提示PARP-1高表達是胃癌，特別是幽門螺桿菌陽性的胃癌患者預后不良的重要預測指標。目前有研究發現PARP-1抑制劑對BRCA1/2突變的乳腺癌及卵巢癌細胞有明顯抑制作用，并具有放化療增敏作用[15-16]。本研究結果顯示，PARP-1高表達組術后轉移復發率明顯高于低表達組，1、2、3、4年無病生存率明顯低于低表達組，差異均有統計學意義。

綜上所述，治療前PARP-1高表達，提示局部進展期直腸癌標準治療后臨床轉歸較差。