HtrA4在子癇前期孕婦胎盤組織中的表達及與滋養細胞缺氧的相關性

徐曉敏 汪文寰 孫聰聰 王葉平 李曉慶

子癇前期（preeclampsia，PE）是指孕婦妊娠20周以后新發高血壓伴蛋白尿，病情嚴重時可發生全身多臟器病變的母胎致病/致死疾病，發病率約為5%～7%[1]。滋養細胞侵襲過淺引起胎盤缺氧，釋放多種炎性因子進入母體血液循環，最終導致血管內皮損傷和全身系統性炎癥反應，是PE發病的潛在機制[2]。高溫必需因子 A4（high-temperature requirement A4,HtrA4）是一類絲氨酸蛋白酶，參與了滋養細胞增殖、侵襲和應激調控[3]。研究表明，HtrA4與PE的發病相關，但其在PE孕婦胎盤組織中的表達水平及調控機制仍不明確[4-7]。而HtrA4表達是否與滋養細胞缺氧關鍵指標——缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor 1alpha,HIF-1α）相關也未見報道。本研究通過基因表達綜合（gene expression omnibus，GEO）數據庫和胎盤組織驗證，明確HtrA4的表達情況，探討HtrA4表達水平與滋養細胞缺氧及HIF-1α表達的相關性，為基于HtrA4的PE發病機制研究和防治策略提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料 Bewo滋養細胞購自中國典型培養物保藏中心。細胞培養基和FBS均購自美國Gibco公司；LipofectamineTM3000和逆轉錄試劑盒均購自美國Thermo Fisher公司；Matrigel基質膠和Transwell小室均購自美國Corning公司；HtrA4和HIF-1α抗體均購自中國Proteintech公司；MTT試劑盒和BCA蛋白檢測試劑盒均購自中國碧云天生物技術有限公司；氯化鈷（CoCl2）購自中國阿拉丁公司。引物和小干擾RNA（small interfering RNA,siRNA）序列均由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 GEO芯片數據分析 通過GEO數據庫查詢并納入PE孕婦胎盤組織基因芯片數據集，共計11組。數據納入標準：（1）人PE或正常胎盤組織；（2）PE組和對照組樣本例數均＞5例。采用GEO2R軟件[8]篩選數據集中差異表達基因（differentially expressed genes,DEGs）。篩選標準如下：（1）P＜0.05；（2）差異倍數（fold change，FC）≥2，即log2（FC）≥1。采用“RobustRankAggreg”R語言包[9]對11組數據集中的DEGs進行合并，篩選共同DEGs。富集分析采用Metascape基因功能分析平臺[10]。

1.2.2 胎盤組織驗證 胎盤組織采集自2019年1至6月在溫州市人民醫院行剖宮產分娩的PE孕婦9例（PE組）和無妊娠并發癥的擇期剖宮產分娩孕婦9例（對照組）。PE組納入標準：符合《婦產科學》[11]中的PE診斷標準。排除標準：（1）非自然受孕者；（2）雙胎或多胎妊娠者；（3）有慢性高血壓史、心血管疾病史、腎臟疾病史或糖尿病史者。對照組排除妊娠并發癥和合并癥的擇期剖宮產分娩孕婦。兩組孕婦年齡、BMI、孕次、產次比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。胎盤經剖宮產娩出后，取基底層和絨毛膜板間1 cm3組織，預冷PBS沖洗去除血液后，液氮保存。本研究經醫院醫學倫理委員會審批通過，所有孕婦均簽署知情同意書。

表1 兩組孕婦一般情況比較

1.2.3 細胞培養及siRNA干擾 Bewo滋養細胞采用含10% FBS的Ham's F12k培養基，在37℃、5% CO2和20% O2條件下常規培養。細胞培養至對數生長期，以1×105個/孔接種至24孔板；常規培養至近70%融合時，用無血清培養基清洗細胞，采用LipofectamineTM3000轉染細胞，qRT-PCR評估干擾效率，干擾效率≥60%說明干擾成功；HtrA4 siRNA序列：5'-ACUGUACACAGGAACAAGCTT-3'，HIF-1α siRNA 序列：5'-GCUCUUCGACAAGCUUAATT-3'。

1.2.4 細胞增殖實驗及侵襲實驗 Bewo滋養細胞分別經HtrA4 siRNA（HtrA4 siRNA干擾組）和陰性對照siRNA（陰性對照組）轉染后，以未經干擾細胞作為空白對照（空白組），檢測細胞增殖和侵襲活性。細胞增殖實驗采用MTT法，每組細胞按5×104個/孔接種細胞，分別檢測24、48和72 h細胞增殖活性，每個時間點均重復3次，操作嚴格按照MTT試劑盒說明書。侵襲實驗采用Transwell法，每組細胞重懸計數濃度為2×105個/ml；將Matrigel與無血清培養基按照1：8比例混合均勻，加入Transwell小室底部待凝固；小室下孔加入15% FBS的 Ham's F12k培養基，小室中加入200μl無血清的細胞懸液，每組細胞做2個復孔；48 h后，甲醇固定，0.1%結晶紫染色并計數，每組計數4個視野。

1.2.5 細胞缺氧實驗 滋養細胞缺氧模型采用低氧（1% O2）誘導和 HIF-1α 激活劑 CoCl2誘導。按 1×106個/孔接種細胞，常規培養48 h后，分為HIF-1α激活組、低氧組和對照組。HIF-1α激活組：采用含200μM HIF-1α激活劑CoCl2的10% FBS的Ham's F12k培養基，37℃、20% O2、5% CO2繼續培養 24 h；低氧組：37 ℃、1% O2、5% CO2繼續培養24 h；對照組：繼續常規培養24 h。為進一步觀察抑制HIF-1α對HtrA4的影響，設立缺氧條件下的HIF-1α抑制組，即細胞經HIF-1αsiRNA干擾后，按1×106個/孔接種細胞，常規培養48 h，再在37℃、1% O2、5% CO2條件下培養 24 h。

1.2.6 HtrA4和HIF-1α蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。使用細胞裂解液將細胞或胎盤組織裂解后，取上清液，BCA法測定總蛋白濃度；30μg蛋白上樣，經15% SDS-PAGE電泳分離后將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1.5 h；按照抗體說明書中建議的使用濃度，用TBST配置一抗工作液，并將PVDF膜置于工作液中4℃孵育過夜；TBST溶液漂洗PVDF膜后，加入二抗，室溫孵育1.5 h；TBST溶液漂洗，進行顯影，Quantity One軟件掃描各條帶的光密度并分析結果。

1.2.7 HtrA4和HIF-1αmRNA表達水平檢測 采用qRT-PCR法。提取細胞或胎盤組織RNA后逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，qRT-PCR法檢測樣本中HtrA4和HIF-1αmRNA表達水平。HtrA4上游引物：5'-GTCAGCACCAAACAGCG-3'，下游引物：5'-GGAGATTCCATCAGTCACCC-3'；HIF-1α 上游引物：5'-GTTAGTTCAATTTTGATCCCCTTTCT-3'，下游引物：5'-GCTACTGCAATGCAATGGTTTAA-3'。

1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism 8.0統計軟件。符合正態分布的計量資料以表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用秩和檢驗。采用Pearson相關分析HtrA4與HIF-1αmRNA表達水平的相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DEGs篩選與富集分析 11組芯片數據集篩選獲得13個共同DEGs，其中上調表達基因12個，下調表達基因1個。HtrA4在各數據集中均上調表達，log2（FC）為0.84～2.74，校正后P＜0.05。DEGs及表達量見圖1。HtrA4具有分泌活性，參與細胞外基質的形成及調控細胞對生長因子刺激反應，DEGs富集分析結果見表2。

表2 DEGs富集分析

圖1 11組芯片數據集中的共同上下調差異表達基因（DEGs）

2.2 兩組孕婦胎盤組織HtrA4和HIF-1α表達水平比較 與對照組比較，PE組孕婦胎盤組織HtrA4蛋白和mRNA表達水平均上調，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與對照組比較，PE組孕婦胎盤組織 HIF-1α mRNA表達水平上調，差異有統計學意義（P＜0.05）；但兩組孕婦HIF-1α蛋白表達水平比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表 3和圖2。

表3 兩組孕婦胎盤組織HtrA4和HIF-1α表達水平比較

圖2 兩組孕婦胎盤組織高溫必需因子A4（HtrA4）和缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）蛋白表達的電泳圖（PE為子癇前期）

2.3 各組細胞增殖和侵襲活性比較 HtrA4 siRNA干擾組（干擾效率為77.84%）、陰性對照組和空白組24、48和72 h細胞增殖活性比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表4。與陰性對照組比較，HtrA4 siRNA干擾組細胞侵襲活性明顯減弱，穿過小室基底膜的鏡下細胞數明顯減少。與陰性對照組比較，HtrA4 siRNA干擾組侵襲活性下降（64.93±1.46）%，差異有統計學意義（t=44.41，P＜0.05），見圖 3。

圖3 小干擾RNA（siRNA）干擾高溫必需因子A4（HtrA4）對滋養細胞侵襲的影響（a：HtrA4 siRNA干擾細胞后，穿過小室基底膜的鏡下細胞數明顯減少；b：與陰性對照組比較，HtrA4 siRNA干擾組侵襲活性下降，*P＜0.05）

表4 各組細胞增殖活性比較

2.4 細胞缺氧對HtrA4表達的作用 與對照組比較，HIF-1α激活組、低氧組HtrA4和HIF-1α蛋白、mRNA表達水平均上調，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與低氧組比較，HIF-1α抑制組（HIF-1αsiRNA干擾效率為61.50%）HtrA4和HIF-1α蛋白和mRNA表達水平均下調，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表5和圖4。Pearson相關分析發現各組細胞HtrA4與HIF-1α mRNA表達水平呈正相關（r=0.87，P＜0.01）。

表5 各組細胞HtrA4和HIF-1α mRNA表達水平比較

圖4 細胞缺氧對細胞高溫必需因子A4（HtrA4）和缺氧誘導因子 -1α（HIF-1α）蛋白表達的影響

3 討論

HtrA4是促進胎盤滋養細胞侵襲，抑制上皮細胞功能并促進子宮螺旋動脈重塑的關鍵蛋白[4，7]。本研究對11組PE芯片數據分析及胎盤組織驗證的結果顯示，PE孕婦胎盤組織HtrA4表達水平明顯高于正常妊娠女性，這與文獻報道一致[5-7]。筆者對HtrA4 siRNA干擾實驗表明，抑制HtrA4表達將下調滋養細胞的侵襲活性，但對滋養細胞增殖活性并無影響。Wang等[4]對HtrA4的體外機制研究認為，HtrA4一方面通過降解細胞基質纖連蛋白來抑制纖連蛋白與整合素受體作用，另一方面通過裂解合胞素-1抑制細胞間融合，促進滋養細胞的侵襲能力。而HtrA4的表達雖然有利于滋養細胞侵襲，但部分研究顯示，HtrA4在PE孕婦胎盤中過表達并游離至血清將誘導內皮損傷及抑制內皮正常功能，促進PE發展[12-14]。因此，精確調控HtrA4的表達可能對維持細胞侵襲和抑制PE發展具有重要作用。

目前，HtrA4的調控機制尚不明確，結合HtrA4的基因與蛋白功能和在PE孕婦胎盤組織中表達上調，筆者認為HtrA4可能受細胞應激狀態如細胞缺血缺氧等作用，反饋促進細胞侵襲。胎盤缺氧是PE的早期特征之一，胎盤中低氧誘導的轉錄因子和基因特異性表達是PE發病的核心因素[15-17]。研究顯示HIF-1α在PE患者胎盤組織和體內/體外模型中高表達，參與PE發病[18-19]，本研究HIF-1αmRNA驗證結果與其一致，但PE組和對照組間HIF-1α蛋白表達水平比較差異無統計學意義，這可能與HIF-1α蛋白表達水平低且易降解有關。Liu等[7]檢測滋養細胞HTR-8在1% O2環境下的HtrA4表達水平，結果顯示HtrA4在缺氧環境中呈高表達。本研究通過低氧（1% O2）細胞模型實驗也證實，缺氧可誘導滋養細胞HtrA4表達上調。進一步采用激動或抑制低氧條件下HIF-1α表達顯示，HtrA4表達與HIF-1α相關，部分受其調控。而HIF-1α誘導HtrA4表達的具體機制，有待于進一步研究。

綜上所述，本研究證實HtrA4在PE孕婦胎盤組織中表達顯著上調，可促進HtrA4的侵襲能力，并發現HtrA4的表達與滋養細胞缺氧和HIF-1α表達水平相關。孕期監測和靶向調控HtrA4的表達可能是防治PE的有效途徑。此外，本研究對GEO數據庫PE孕婦胎盤組織基因芯片進行分析，得到13個DEGs，其中基因如LEP、FSTL3、PAPPA2 已被證實與 PE 發病相關[20-22]，而較多基因在PE孕婦胎盤組織中的表達和臨床意義仍有待于實驗驗證。