系統(tǒng)生物學(xué)方法在骨質(zhì)疏松癥中醫(yī)證候研究中的應(yīng)用?

章軼立，齊保玉，魏 戌△，戴建業(yè)，王 旭，申 浩，謝雁鳴

(1. 中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102； 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029； 3.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，蘭州 730020； 4. 北京市豐臺區(qū)長辛店社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，北京 100072； 5.中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis, OP)主要表現(xiàn)為骨代謝異常，以全身性骨痛和易發(fā)生脆性骨折為特征性表現(xiàn)，與增齡關(guān)系密切，發(fā)病率呈逐年遞增趨勢[1]。中醫(yī)藥在提高OP患者骨密度、改善臨床癥狀、促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折愈合等方面具有一定的優(yōu)勢[2-3]。證候作為中醫(yī)臨床診治的重要依據(jù)，是中醫(yī)學(xué)研究中的核心要素與學(xué)理支點(diǎn)[4]。系統(tǒng)生物學(xué)是研究生物系統(tǒng)中所有組分(如基因、蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物等)構(gòu)成，以及在特定條件下(如遺傳、環(huán)境變化等)各組分之間相互關(guān)系的學(xué)科，以多種組學(xué)技術(shù)為代表，為闡釋中醫(yī)證候生物學(xué)基礎(chǔ)與辨證論治的科學(xué)內(nèi)涵提供了重要的方法學(xué)支撐[5-7]。現(xiàn)就近年來系統(tǒng)生物學(xué)方法在OP中醫(yī)證候研究中的應(yīng)用進(jìn)行述評。

1 基因組學(xué)研究

基因組學(xué)關(guān)注微觀的、相對穩(wěn)定的生物基因精確結(jié)構(gòu)、相互關(guān)系及表達(dá)調(diào)控，強(qiáng)調(diào)基因表達(dá)的差異是造成個(gè)體差異的主要原因。證候基因組學(xué)是在中醫(yī)證候?qū)W理論指導(dǎo)下，運(yùn)用基因組學(xué)的方法探討OP中醫(yī)證候的科學(xué)內(nèi)涵，特別是研究同病異證或異病同證時(shí)基因的差異表達(dá)情況，揭示與證候形成相關(guān)的基因及其功能[8-9]。

腎藏精，主骨生髓，腎虛證與OP發(fā)病關(guān)系密切。鄭洪新等[10]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，OP腎虛證病理機(jī)制與轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、TGFβ誘導(dǎo)早期應(yīng)答基因1(TGF-β inducible early gene, TIEG1)mRNA等表達(dá)異常有關(guān)，并運(yùn)用補(bǔ)腎益髓中藥發(fā)揮對下丘腦-腎-骨反饋機(jī)制的調(diào)控作用以預(yù)防OP的發(fā)生發(fā)展。尚德陽等[11]發(fā)現(xiàn)，OP的發(fā)生可能與骨、腎、下丘腦組織中Smad泛素化調(diào)節(jié)因子1(Smad ubiquitination regulatory factor 1, Smurf1)和Smad泛素化調(diào)節(jié)因子2(Smad ubiquitination regulatory factor 2, Smurf2)的mRNA表達(dá)的異常變化有關(guān)，補(bǔ)腎中藥可能通過調(diào)控上述因子表達(dá)發(fā)揮防治OP的作用。王愛堅(jiān)等[12]研究提示，載脂蛋白E等位基因ε4頻率升高與絕經(jīng)后婦女腎虛證發(fā)生關(guān)系密切，腎虛證與載脂蛋白E基因多態(tài)性存在聯(lián)系。

在絕經(jīng)后OP易感基因與基因多態(tài)性研究方面，國內(nèi)葛繼榮教授團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果表明，OP證候與遺傳特征可能存在關(guān)聯(lián)性，在維生素D受體基因bb型中，絕經(jīng)后OP腎陰陽兩虛證腰椎骨密度明顯低于腎陰虛證患者[13]。另有研究證實(shí)[14-15]，絕經(jīng)后OP腎陽虛證與骨鈣素基因多態(tài)性、雌激素受體基因多態(tài)性存在關(guān)聯(lián)，而腎陰虛證的發(fā)生與lncRNA uc431+的表達(dá)下調(diào)、富亮氨酸2糖蛋白1(leucine-rich-alpha-2-glycoprotein1, LRG1)的mRNA表達(dá)升高有關(guān)[16-18]。研究還發(fā)現(xiàn)，LINC00334等8條lncRNAs可能通過調(diào)控Janus激酶/信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(janus kinase/signal transducer and activator of transcription, JAK/STAT)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)等信號通路參與絕經(jīng)后OP腎陰虛證的發(fā)生發(fā)展過程[19]。此外，李穎等[20]研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后OP中醫(yī)證候與線粒體DNA拷貝數(shù)、DNA氧化損傷的產(chǎn)物8-羥基脫氧鳥苷酸含量存在相關(guān)性，其中肝腎陰虛證與線粒體DNA拷貝數(shù)相關(guān)性高，脾腎陽虛證與8-羥基脫氧鳥苷酸關(guān)系密切。李生強(qiáng)等已完成對原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥腎陰虛證、腎陽虛證骨組織基因表達(dá)譜的測定，不同腎虛證候相關(guān)基因均與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)，腎陰虛證基因還與激素合成、組氨酸代謝、礦物質(zhì)吸收等通路相關(guān)，而腎陽虛證基因還與TGF-β、細(xì)胞周期等信號通路相關(guān)[21-22]。

基于現(xiàn)有文獻(xiàn)，目前針對OP證候的基因組學(xué)研究主要停留在個(gè)別基因?qū)P證候的關(guān)聯(lián)，并未從整體的角度探究OP證候發(fā)生發(fā)展的本質(zhì)問題，未來研究仍需構(gòu)建OP非腎虛證候相關(guān)的基因差異表達(dá)譜，篩選出與之有關(guān)的基因，并從功能基因組學(xué)的角度對其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。同時(shí)，從“同病異證”和“同證異病”的角度比較基因表達(dá)譜的差異，尋找OP證候的同一性和差異性，進(jìn)而揭示OP證候的科學(xué)內(nèi)涵，并為其客觀化診斷提供依據(jù)。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)研究

蛋白質(zhì)組學(xué)是對基因組學(xué)的繼承與發(fā)展，可系統(tǒng)分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成、表達(dá)水平和修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間存在的相互關(guān)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律[23-24]。證候蛋白質(zhì)組學(xué)研究有助于獲得疾病證候的生物學(xué)實(shí)質(zhì)與生物標(biāo)志物，進(jìn)一步使證候研究走向客觀化與標(biāo)準(zhǔn)化[25]。

國內(nèi)學(xué)者已初步發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后OP腎陽虛證與LTBP1蛋白表達(dá)下調(diào)相關(guān)聯(lián)，而腎陰虛證與CLCFI蛋白下調(diào)存在關(guān)聯(lián)[26-28]。王蕾等[29]研究發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞相關(guān)因子蛋白表達(dá)水平與腎陽虛證、脾胃虛弱證、肝腎陰虛證、氣滯血瘀證具有相關(guān)性。其中，巨噬細(xì)胞集落刺激因子、核因子κB受體活化因子可作為區(qū)別腎陽虛證與其他證候的生物標(biāo)志物。

鄧洋洋等[30]發(fā)現(xiàn)，腎虛OP模型大鼠Smurf1蛋白在股骨、腎中表達(dá)降低，在下丘腦中表達(dá)水平升高，而補(bǔ)腎中藥可能通過調(diào)控股骨、腎、下丘腦中Smurf1表達(dá)發(fā)揮防治原發(fā)性O(shè)P的作用。章建華等[31-32]運(yùn)用左歸丸與右歸丸含藥血清，對去卵巢大鼠腎陰虛證與腎陽虛證動(dòng)物模型進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果證實(shí)兩方均能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖與堿性磷酸酶表達(dá)水平，并對細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)與β-catenin的蛋白表達(dá)具有一定調(diào)控作用。此外，對比不同動(dòng)物模型中蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，“左歸丸滋腎陰”作用更強(qiáng)，而“右歸丸溫腎陽”作用更強(qiáng)，與中醫(yī)理論相符。伍超等[33]結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)腎精虧虛證可能與促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin, EPO)信號通路中低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1)、生長因子受體結(jié)合蛋白2(growth factor receptor-bound protein 2, GRB 2)、MAPK3等蛋白密切相關(guān)，而補(bǔ)腎益精中藥通過調(diào)控EPO信號通路中靶點(diǎn)蛋白水平的降低，可能是治療腎精虧虛證的作用機(jī)制之一。另1項(xiàng)研究表明，電針命門穴可促進(jìn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)及其信號傳導(dǎo)蛋白Smad1/5表達(dá)水平，為電針治療絕經(jīng)后OP提供了基礎(chǔ)研究證據(jù)[34]。

與證候基因組學(xué)的研究現(xiàn)狀相似，OP證候?qū)用娴牡鞍踪|(zhì)組學(xué)研究仍然集中于對療效機(jī)制的科學(xué)闡釋，多數(shù)聚焦于補(bǔ)腎類中藥可能作用的靶點(diǎn)。而從證候衍變規(guī)律角度出發(fā)，探索證候動(dòng)態(tài)變化及其生物學(xué)內(nèi)涵的相關(guān)研究還不夠深入，尚未形成完整的OP證候蛋白質(zhì)組學(xué)證據(jù)鏈。

3 代謝組學(xué)研究

代謝組學(xué)是對生物體內(nèi)的代謝物進(jìn)行定量分析，試圖尋找代謝物與生理病理變化相對關(guān)系的研究，也是系統(tǒng)生物學(xué)的重要技術(shù)方法之一[35-36]。OP屬于全身代謝性疾病，代謝組學(xué)為OP臨床診斷和治療提供了一種整體的方法，對深入理解OP病理機(jī)制及中藥等干預(yù)機(jī)制具有重要作用[37]。證候代謝組學(xué)通過測定不同證候間代謝產(chǎn)物的差異，為證候生物學(xué)基礎(chǔ)研究開辟了新途徑。

徐琬梨等[38]應(yīng)用核磁共振氫譜技術(shù)測定絕經(jīng)后OP常見實(shí)證(腎虛對照組、腎虛血瘀組、腎虛痰濕組、腎虛氣滯組)血清代謝產(chǎn)物，結(jié)果表明各組間存在差異代謝物，主要生物學(xué)功能涉及體內(nèi)能量代謝、氨基酸代謝、蛋白代謝等方面，證實(shí)不同中醫(yī)證候與代謝產(chǎn)物密切相關(guān)。張波等[39]通過OP腎虛血瘀證與骨質(zhì)疏松癥常規(guī)檢測指標(biāo)相關(guān)性研究證實(shí)，OP腎虛血瘀證可能與血清Ⅰ型膠原C末端肽、骨密度、25羥維生素D、雌二醇等具有相關(guān)性。帥波等[40]研究證實(shí)，骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物β-骨原交聯(lián)、血清白細(xì)胞介素-6、腫瘤壞死因子含量與中醫(yī)“本痿標(biāo)痹”證候評分存在正相關(guān)，建議骨代謝與炎癥指標(biāo)可作為OP進(jìn)展評價(jià)及療效判定的依據(jù)。

當(dāng)前多數(shù)研究雖然通過對骨代謝指標(biāo)相關(guān)產(chǎn)物檢測，發(fā)現(xiàn)與OP證候相關(guān)的部分代謝指標(biāo)，但針對骨代謝終端產(chǎn)物的代謝組學(xué)研究依然較少。此外，在中醫(yī)藥干預(yù)OP的作用機(jī)制研究中，雖然應(yīng)用了代謝組學(xué)方法，但因與證候關(guān)聯(lián)性較弱，因此未引用相關(guān)原始研究文獻(xiàn)。

除應(yīng)用基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)方法研究OP證候外，還有學(xué)者運(yùn)用表觀遺傳學(xué)方法研究中醫(yī)證候，主要表觀遺傳機(jī)理是miRNA、DNA甲基化，但相關(guān)研究仍處于探索階段[41]。

4 討論

隨著生命科學(xué)大數(shù)據(jù)時(shí)代的到來，組學(xué)技術(shù)廣泛運(yùn)用于中醫(yī)中藥研究，各種組學(xué)方法已在證候生物學(xué)基礎(chǔ)研究方面取得了積極進(jìn)展[43]。系統(tǒng)生物學(xué)因其強(qiáng)調(diào)整體性、時(shí)效性的特點(diǎn)與中醫(yī)學(xué)整體觀念、辨證論治的思想較為吻合[44]，借助系統(tǒng)生物學(xué)的方法與思路，不僅豐富了OP證候的理論內(nèi)涵，拓寬了研究思路，也有助于搭建微觀研究(基因、蛋白、代謝組學(xué)研究)與整體研究(證候研究)的橋梁，為OP證候客觀化提供科學(xué)依據(jù)[45]。

盡管目前運(yùn)用系統(tǒng)生物學(xué)進(jìn)行OP證候本質(zhì)研究尚處于探索、發(fā)展階段，但基于系統(tǒng)生物學(xué)特點(diǎn)、研究思路、技術(shù)方法為OP證候本質(zhì)的研究帶來了新的方向[46-47]。因此，將系統(tǒng)生物學(xué)運(yùn)用于OP證候研究，建立多方向、多層次的組學(xué)技術(shù)平臺，并通過計(jì)算生物學(xué)等數(shù)學(xué)語言定量描述生物體功能、表型及行為，對揭示OP證候本質(zhì)具有重要意義，進(jìn)而促進(jìn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究進(jìn)程。