IL-18、IL-10在乳腺癌組織中的表達與患者淋巴結轉移的相關性

馬騰　劉巧紅　林文俐　高愛琴

【摘要】 目的：探討IL-18、IL-10在乳腺癌組織中的表達情況及其與淋巴結轉移的相關性。方法：選取2017年11月-2019年6月山東大學附屬濟南市中心醫院經手術切除并經病理確診的104例乳腺癌組織及31例乳腺纖維腺瘤組織標本，應用免疫組織化學方法檢測IL-18和IL-10的表達情況，比較乳腺癌組織及乳腺纖維腺瘤組織中IL-18和IL-10的表達情況;分析IL-18和IL-10表達的相關性;比較有無淋巴結轉移的乳腺癌組織中IL-18和IL-10表達的表達情況;比較不同其他臨床病理特征的乳腺癌組織中IL-18和IL-10表達情況。結果：乳腺癌組織的多數腫瘤細胞中IL-18表達陽性，其染色部位位于細胞膜及胞漿，呈彌漫性分布。乳腺癌組織中IL-18陽性表達率為75.0%（78/104），高于乳腺纖維腺瘤組織的19.4%（6/31），差異有統計學意義（P<0.001）。乳腺癌組織中多數細胞IL-10呈陽性表達，主要染色位于腫瘤細胞的胞漿。乳腺癌組織IL-10陽性表達率為78.8%（82/104）高于乳腺纖維腺瘤組織的22.6%（7/31）（P<0.001）。乳腺癌組織中IL-18與IL-10的表達呈正相關（r=0.533，P<0.05）。有淋巴結轉移的乳腺癌組織中IL-18、IL-10均呈高表達;IL-18的陽性表達率為82.8%（53/64），IL-10的陽性表達率為85.9%（55/64），均高于無淋巴結轉移的62.5%（25/40）、67.5%（27/40），差異均有統計學意義（P<0.05）。不同年齡、腫物最大直徑、組織學類型、分化程度、臨床分期、ER、PR和HER2/neu狀態的乳腺癌組織中IL-18、IL-10的表達情況比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。結論：與乳腺纖維腺瘤組織比較，IL-18、IL-10在乳腺癌組織中高表達，且兩者的表達呈正相關，均與淋巴結轉移具有一定相關性，IL-18與IL-10可能通過相互作用促進乳腺癌進展，兩者可作為乳腺癌患者的診斷指標及不良預后標志物。

【關鍵詞】 乳腺癌 IL-18 IL-10 淋巴結轉移

[Abstract] Objective： To investigate the expression of IL-18 and IL-10 in breast cancer tissues and their correlation with lymph node metastasis. Method： From November 2017 to June 2019 in Jinan Central Hospital affiliated to Shandong University， 104 cases of breast cancer tissues and 31 cases of breast fibroadenoma tissue samples that were surgically resected and pathologically confirmed were selected to detect the expression of IL-18?and IL-10 by immunohistochemistry. The expressions of IL-18 and IL-10 in breast cancer tissue and breast fibroadenoma tissue were compared. The correlation of IL-18 and IL-10 expression was analyzed. The expressions of IL-18 and IL-10 in breast cancer tissues with or without lymph node metastasis were compared. The expressions of IL-18 and IL-10 in breast cancer tissues with different clinicopathologic features were compared. Result： IL-18?was positively expressed in most tumor cells of breast cancer tissue， and its staining sites were located in the cell membrane and cytoplasm， presenting a diffuse distribution. The positive expression rate of IL-18 in breast cancer tissue was 75.0% （78/104）， which was higher than 19.4% （6/31） in breast fibroadenoma tissue， and the difference was statistically significant （P<0.001）. IL-10 was positively expressed in most cells of breast cancer tissue， and mainly stained in the cytoplasm of tumor cells. The positive expression rate of IL-10 in breast cancer tissues was 78.8% （82/104）， which was higher than 22.6% （7/31） in breast fibroadenoma tissues （P<0.001）. There was a positive correlation between IL-18 and IL-10 expression in breast cancer tissue （r=0.533， P<0.05）. IL-18 and IL-10 were highly expressed in the breast cancer tissues with lymph node metastasis; the positive expression rate of IL-18 was 82.8% （53/64）， and that of IL-10 was 85.9% （55/64）， both of which were higher than 62.5% （25/40） and 67.5% （27/40） in breast cancer tissues without lymph node metastasis， with statistical significance （P<0.05）. There were no statistical significance in the expressions of IL-18 and IL-10 in breast cancer tissues with different ages， maximum tumor diameter， histological type， degree of differentiation， clinical stage， ER， PR and HER2/neu status （P>0.05）. Conclusion： Compared with breast fibroadenoma tissue， IL-18 and IL-10 are highly expressed in breast cancer tissue， and their expressions are positively correlated and correlated with lymph node metastasis. IL-18 and IL-10 may promote the progression of breast cancer through interaction， and both can be used as diagnostic indicators and poor prognostic markers for breast cancer patients.

[Key words] Breast cancer IL-18 IL-10 Lymph node metastasis

First-author’s address： The Fifth People’s Hospital of Ji’nan， Ji’nan 250000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.22.008

乳腺癌是世界上女性發病率最高的惡性腫瘤，約占女性新發癌癥病例的15%，嚴重威脅女性生命健康[1]。盡管近年來手術、放療、化療、內分泌治療和靶向治療都取得了很大進展，但進展期和晚期轉移性乳腺癌患者的預后仍然很差。IL-18是一種多功能的細胞因子[2]，在多種實體腫瘤細胞包括肺轉移癌、晚期胃癌和食管癌中過表達，可以促進Th1細胞的細胞毒性作用，后者通過識別殺傷性細胞毒性T細胞（CTL）導致其凋亡增多和攻擊力下降，從而促進腫瘤細胞生長。IL-10是經典的免疫抑制性細胞因子[3]，在細胞免疫應答及促炎癥因子分泌中發揮極其重要的抑制作用。既往臨床研究發現IL-10在胃癌、食管癌及卵巢癌等惡性腫瘤患者血清中表達水平明顯高于健康人，可能具有促進腫瘤生長作用[4-6]。但是關于兩者在乳腺癌組織中的表達情況及兩者之間關系如何，目前鮮有報道。本研究應用免疫組織化學方法檢測IL-18與IL-10在乳腺癌患者組織標本中的表達情況及兩者的相關性，并分析兩者與患者淋巴結轉移及其他臨床病理特征的關系，旨在探究乳腺癌發生發展的免疫機制，為患者診斷及預后評估提供新的手段，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 所有組織標本取自2017年11月-

2019年6月在山東大學附屬濟南市中心醫院普外科行手術切除并經過病理確診的135例乳腺腫瘤患者，其中104例為乳腺癌患者，年齡28～69歲，平均54.5歲;依據WHO（2003年）組織學分級標準[7]，Ⅰ級23例，Ⅱ級47例，Ⅲ級34例;根據AJCC（2016年）TNM臨床分期標準，Ⅰ期23例，Ⅱa期30例，Ⅱb期17例，Ⅲa期19例，Ⅲb期15例。另31例乳腺纖維腺瘤患者作為對照，年齡28～36歲，平均28.4歲。納入標準：既往無惡性腫瘤病史;術前未行抗腫瘤相關治療，如新輔助化療、內分泌治療、靶向治療和放療等;患者的基本資料完整。排除標準：患有血液系統疾病、急慢性感染、甲狀腺疾病和其他的良惡性腫瘤。本研究所有標本的取材均經過患者及家屬知情同意并通過山東大學附屬濟南市中心醫院倫理委員會批準。

1.2 方法 所有標本經10%福爾馬林固定，石蠟包埋，制成4 μm厚薄的切片，常規行HE染色和免疫組織化學染色。

1.2.1 主要試劑及儀器 PBS溶液（pH 7.4;邁新PBS-0060磷酸鹽緩沖液粉劑），檸檬酸鹽抗原修復緩沖液（pH 6.0;邁新MVS-0066檸檬酸鹽緩沖液），濃縮型DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司），免疫組織化學Elivision試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司），兔抗人IL-10單克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司），兔抗人IL-18單克隆抗體（北京博奧森生物技術有限公司），顯微鏡（OLYMPUS），脫水機，包埋機，漂烘處理儀、石蠟切片機及烘片機（德國LEICA），電熱恒溫水浴箱（北京市醫療設備廠）。

1.2.2 HE染色 將乳腺纖維腺瘤及乳腺癌組織蠟塊分別連續切片5張，切片厚4 μm，于60 ℃恒溫箱中烤片60 min，將切片經二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ浸泡后分別用100%、95%、85%、75%的梯度酒精依次沖洗，然后給予蘇木素和伊紅染色，中性樹膠封片、晾干，確定標本的組織分化程度。

1.2.3 免疫組化檢測 選取石蠟切片標本置60 ℃烤箱烘烤60 min后室溫存放，二甲苯脫蠟，梯度酒精依次沖洗，檸檬酸鹽抗原修復緩沖液（pH=6.0）對組織抗原進行高壓修復（95 ℃，2 min），室溫自然冷卻，每張切片滴加一抗工作液50 μL，濕盒放入37 ℃水浴箱中孵育90 min，PBS沖洗后滴加二抗，37 ℃孵育20 min，DAB（二氨基聯苯胺）顯色經蘇木素復染、脫水、透明后封片。

1.3 結果判定 每張切片均由兩位病理科醫生雙盲法閱片，計數差10%以上重新計數。DAB顯色后以細胞內出現棕黃色或棕黃色顆粒為陽性。結果判斷采用半定量積分法，每張切片于200倍鏡下隨機選擇3個視野，根據陽性細胞比例及著色深淺計分，著色細胞<1/3計1分;著色細胞1/3～2/3計2分;>2/3計3分[8]。著色深度：無著色計0分;淺黃色計1分;棕黃色計2分;棕褐色計3分。二者乘積為該組織所得分值。按分值進行評定，≤2分為陰性;≥3分為陽性（3分為弱陽性，4～5分為陽性，6～9分為強陽性）。對于IL-10，染色強度未著色為0分、淺黃色為1分、淺黃色與黃色之間為2分、黃色至棕黃色為3分;陽性細胞比率評分：0為0分、1%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、76%～100%為4分;總分=染色強度評分×陽性細胞比率評分;≤2分為陰性;≥3分為陽性。

1.4 統計學處理 結果采用SPSS 22.0統計學軟件進行處理。計數資料以率（%）表示，IL-18在人乳腺癌組織中的表達與IL-10及患者臨床病理參數之間的關系，采用字2檢驗和Pearson列聯系數分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌與乳腺纖維腺瘤組織細胞中IL-18的表達情況 乳腺癌組織的多數腫瘤細胞中IL-18表達陽性，其染色部位位于細胞膜及胞漿，呈彌漫性分布（圖1A）;在乳腺纖維腺瘤組織中，多數細胞IL-18呈現陰性表達（圖1B）。乳腺癌組織中IL-18陽性表達率為75.0%（78/104），高于乳腺纖維腺瘤組織的19.4%（6/31），差異有統計學意義（P<0.001），見圖1C。

2.2 乳腺癌與乳腺纖維腺瘤組織細胞中IL-10的表達情況 乳腺癌組織中多數細胞IL-10呈陽性表達，主要染色位于腫瘤細胞的胞漿（圖2A），而乳腺纖維腺瘤組織中，IL-10表達相對較低（圖2B）。乳腺癌組織IL-10陽性表達率為78.8%（82/104）高于乳腺纖維腺瘤組織的22.6%（7/31），差異有統計學意義（P<0.001），見圖2C。

2.3 IL-18與IL-10在乳腺癌組織中表達的相關性 乳腺癌組織中IL-18與IL-10的表達呈正相關（r=0.533，P<0.05），見圖3。

2.4 有無淋巴結轉移的乳腺癌組織中IL-18、IL-10的表達情況 有淋巴結轉移的乳腺癌組織中IL-18、IL-10均呈高表達（見圖4A、D），而在無淋巴結轉移的乳腺癌組織中均呈低表達（見圖4B、E）。64例淋巴結轉移的乳腺癌組織中，IL-18的陽性表達率為82.8%（53/64），IL-10的陽性表達率為85.9%（55/64），均高于無淋巴結轉移的62.5%（25/40）、67.5%（27/40），差異均有統計學意義（字2=5.417、5.017，P=0.020、0.025）。見圖4C、F。

2.5 不同其他臨床病理特征乳腺癌組織中IL-18、IL-10的表達情況比較 不同年齡、腫物最大直徑、組織學類型、分化程度、臨床分期、ER、PR和HER2/neu狀態的乳腺癌組織中IL-18、IL-10的表達情況比較，差異均無統計學意義（P>0.05），見表1。

3 討論

乳腺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在女性惡性腫瘤發病率中排名第一[9]。近年來，乳腺癌的發病率和死亡率都呈上升趨勢，年齡上也呈現年輕化，嚴重危害人類健康[10]。雖然目前化療、放療、內分泌治療和靶向治療等手段取得了較大的進展，但是患者的預后仍不盡如人意。因此，探究乳腺癌發生發展機制及尋找新的治療策略已成為當今乳腺癌研究的熱點。近年來興起的免疫治療改變了惡性黑色素瘤、肺癌、頭頸部癌和消化道腫瘤等諸多實體腫瘤的治療模式，是實體腫瘤潛在的治愈性手段。但是在乳腺癌中，除了小部分三陰性乳腺癌患者，免疫治療并未獲得顯著的臨床獲益[11]。因此探尋乳腺癌發生及進展的免疫機制顯得尤為重要。

IL-18是多功能的免疫調控細胞因子。研究證實，IL-18能夠協同體內其他細胞因子如IL-12或IL-15來調節多種免疫細胞的活性。如IL-18能夠與IL-12協同作用活化CD4+/CD8+T細胞及NK細胞，促進其直接的殺傷能力或殺傷性細胞因子IFN-γ的釋放[12]。此外，在沒有IL-12或IL-15等細胞因子存在時，IL-18可誘導初始T細胞向Th2細胞的分化。目前關于IL-18在惡性腫瘤中的作用仍不甚明了。文獻[13]研究顯示，IL-18具有較強的免疫調節活性，可以通過誘導干擾素-γ（IFN-γ）的產生發揮抗感染和抗腫瘤等作用。在小鼠成瘤模型中發現，腎癌腫瘤細胞株中IL-18過表達降低了其在同源小鼠中的致瘤活性，抑制了腫瘤的生長速度[14]。既往的臨床研究中發現，一些惡性腫瘤患者的血清中IL-18的水平明顯升高，并且往往預后較差，在晚期胃癌和食管癌患者血清中IL-18水平顯著高于健康人，并且與患者術后存活率呈負相關，與腫瘤的生長和病理分級呈正相關性[15]。同時皮膚癌、肺轉移癌、NK細胞淋巴瘤患者血清中也發現了IL-18水平顯著升高[16]。本研究發現，IL-18主要表達于乳腺癌腫瘤細胞中，其在乳腺癌組織中陽性表達率高于乳腺纖維腺瘤組織（P<0.05），且和淋巴結轉移相關。IL-18在乳腺癌中可能發揮促腫瘤效應，可作為乳腺癌患者的診斷指標及預后不良的標志物，同時可能是乳腺癌治療的潛在靶點。

IL-10是經典的免疫抑制性細胞因子。研究表明，腫瘤微環境中腫瘤細胞、腫瘤相關巨噬細胞、調節性T細胞等均可釋放IL-10，進而抑制Th1細胞中IL-2、TNF-α及INF-γ的產生，抑制T細胞的增殖及殺傷能力[17-19]。因此IL-10在腫瘤細胞中的高表達是患者腫瘤進展的推動因素及預后不良的標志。既往研究發現IL-18可能通過上調NF-κB的表達和活性，進而抑制IL-10的抑腫瘤作用[20]。有趣的是，IL-10同樣能夠通過NF-κB轉錄激活IL-18表達。本研究發現，乳腺癌組織中IL-10陽性表達率高于乳腺纖維瘤組織（P<0.05），且IL-10在乳腺癌組織中的表達水平與IL-18呈正相關（P<0.05）。李喬等[21]研究發現卵巢癌患者中的巨噬細胞通過釋放IL-10上調腫瘤細胞中乏氧誘導因子1α表達，從而促進癌細胞的侵襲和轉移。孫振華等[22]發現，IL-10在甲狀腺乳頭狀癌組織的腫瘤細胞中表達上調，其表達水平與甲狀腺乳頭狀癌的包膜侵犯及淋巴結轉移有關。這些研究結果與本研究結果一致，提示IL-10可能與IL-18相互調控，共同促進了乳腺癌的發生、發展及轉移等過程，上述結果也從側面證實兩者可能是乳腺癌患者潛在的治療靶點。

綜上所述，與乳腺纖維腺瘤組織比較，IL-18、IL-10在乳腺癌組織中高表達，且兩者的表達呈正相關，均與淋巴結轉移具有一定相關性，IL-18與IL-10可能通過相互作用促進乳腺癌進展，兩者可作為乳腺癌患者的診斷指標及不良預后標志物。但是關于兩者的具體調控機制及作用靶點，還需要進一步研究。

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（收稿日期：2020-10-16） （本文編輯：田婧）