RNA m5C甲基化修飾在腫瘤中的研究進展*

張安琪 安萌 姜博 唐文強 潘麗 付波

RNA 修飾在基因表達調控中發揮重要作用。在不同的生物學進程中，RNA 修飾是動態、可逆且廣泛存在的。目前，已知的RNA 化學修飾達170 多種，RNA 修飾既可以發生在編碼RNA 也可發生在非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA），被稱作“表觀轉錄組”。其中甲基化是最主要的RNA 修飾之一，也是近年的研究熱點。RNA 甲基化修飾主要包括N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）、N1-甲基腺苷（N1-methyladenosine，m1A）、假尿苷（pseudouridine，Ψ）和5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，m5C）修飾等。對于m5C 修飾，過往的研究主要集中于DNA，而RNA 中m5C 修飾的功能及調節機制的研究尚處于起步階段。近年來，隨著甲基化測序技術的發展，在編碼RNA 及非編碼RNA 中均證實了m5C 甲基化修飾的存在[1-3]。RNA m5C 甲基化修飾主要依賴于甲基轉移酶（writers）、去甲基化酶（erasers）及結合蛋白（readers）。RNA m5C 甲基化修飾發揮多種生物學功能，如調節mRNA 的轉運、RNA 的穩定性、翻譯、線粒體活性、壓力應激等。近年來的研究表明，RNA m5C 甲基化修飾參與調節多種腫瘤的發生、發展及侵襲轉移，如膀胱癌[3]、肝癌[4]、頭頸鱗狀細胞癌[5]、膠質瘤[6]等。本文綜述RNA m5C 甲基化修飾的調控機制、功能以及在腫瘤中的研究進展。

1 RNA m5C 甲基化修飾的調節機制

RNA m5C 甲基化修飾是一個動態、可逆的過程，主要調節因子有3 個：m5C 甲基轉移酶、去甲基化酶和m5C 甲基化結合蛋白。RNA m5C 甲基轉移酶主要包含NOL1/NOP2/sun（NSUN）甲基轉移酶和DNA 甲基轉移酶類似物DNMT2，其催化形成5-甲基胞嘧啶。m5C 甲基化結合蛋白通過識別和結合m5C 甲基化位點來發揮作用，去甲基化酶催化RNA m5C 的去甲基化。

1.1 m5C 甲基轉移酶

m5C 甲基轉移酶以S-腺苷-L-甲硫氨酸（Sadenosylmethionine，SAM）作為甲基供體，將甲基轉移至胞嘧啶形成5-甲基胞嘧啶。目前，已知的RNA m5C 甲基轉移酶有10 余種，包括NSUN 家族、DNA甲基轉移酶類似物DNMT2、tRNA 特異性甲基轉移酶TRDMT 家族。

NSUN 家族蛋白含有Rossman 折疊催化結構域和1 個SAM 結合位點。NSUN 家族成員包括NSUN1-NSUN7。NSUN1 直接結合60～80 S 核糖體前體，催化人28S rRNA m5C 修飾。NSUN2 為研究最多的NSUN 家族成員。NSUN2 可以催化多種RNA的m5C 甲基化修飾，如rRNA、tRNA、mRNA、mt-RNA和病毒RNA 等。NSUN2 介導的m5C mRNA 廣泛分布在所有的編碼區。NSUN2 發揮多種生物學功能，如調節上皮細胞分化、HIV-1 轉錄、EB 病毒降解等。NSUN2 在多種腫瘤中高表達，介導腫瘤發生發展。如在膽囊癌中，NSUN2 沉默抑制膽囊癌細胞的增殖及腫瘤形成[7]。在肝癌中，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）H19 是NSUN2 的特異性靶標，m5C 修飾的H19 通過招募Ras-GTPase 激活蛋白結合蛋白1（Ras-GTPase-activating protein SH3 domainbinding protein 1，G3BP1）促進肝癌發生發展[8]。NSUN3 主要定位于線粒體，催化反密碼子環中C34處線粒體編碼的tRNA 甲硫氨酸（mttRNAMet）甲基化。NSUN4 是rRNA 特異性的甲基化轉移酶，以N 端26個氨基酸基序依賴的方式轉運至線粒體。NSUN4 與線粒體調節因子MTERF4 相互作用，募集到線粒體核糖體大亞基，通過甲基化修飾12S rRNA C911 位點，促進線粒體核糖體組裝。NSUN5 定位于核仁，也是rRNA 特異性的甲基轉移酶，催化25S rRNA 的Ⅳ結構域C2278 位點甲基化。在結直腸癌中，高表達的NSUN5 通過調節細胞周期促進腫瘤細胞的增殖[9]。NSUN6 部分存在于高爾基體和中心小體，是tRNA甲基化調節因子，催化C72 位tRNACys和tRNAThr甲基化，影響tRNA 生成。NSUN6 在腫瘤中表達下調，NSUN6 高表達與部分腫瘤預后較好相關[10]。NSUN7介導增強子RNA（enhancer RNA，eRNA）m5C 甲基化修飾。

DNMT2 具有DNA 甲基化酶的序列和結構特征，可以催化胞嘧啶DNA 甲基化。同時，DNMT2 也可以催化C38 位tRNAAsp甲基化。DNMT2 催化的tRNA 甲基化在tRNA 的加工、維持翻譯準確性、穩定性和差異性中發揮重要作用，并可保護其免受核糖核酸酶的裂解。另有兩種甲基轉移酶，TRM4A 和TRM4B，可以特異性催化tRNA m5C 甲基化修飾。綜上所述，甲基轉移酶是RNA m5C 甲基化修飾重要調控因子之一，不同的甲基轉移酶催化一種或多種RNA 的甲基化。盡管目前部分研究已證實甲基轉移酶在部分腫瘤中發揮重要作用，但不同類型的甲基轉移酶在不同腫瘤的發生發展中的作用及機制仍有待闡明。

1.2 去甲基化酶

去甲基化酶（ten-eleven translocation，TET）家族是依賴于Fe（Ⅱ）和α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid，α-KG）的雙加氧酶，其家族成員包括TET1、TET2 和TET3，其中TET3 在細胞核和細胞質均有分布，而TET1 和TET2 多定位于細胞核。TET 酶家族可催化DNA 5-甲基-2'-脫氧胞苷（5-methyl-2'-deoxycytidine，5mdC）氧化形成5-羥甲基-2'-脫氧胞苷（5-hydroxymethyl-2'-deoxycytidine，5hmdC）、5-甲酰基-2'-脫氧胞苷（5-formyl-2' deoxycytidine，5fdC）和5-羧基-2'-脫氧胞苷（5-carboxyl-2'-deoxycytidine，5cadC）。TET 酶家族也可以作為RNA 去甲基酶，對編碼RNA 和非編碼RNA 中的5-甲基胞苷（5-methylcytidine，5mrC）及其氧化類似物均具有活性，包括5-羥甲基胞苷（5-hydroxymethylcytidine，5hmrC）、5-甲酰基胞苷（5-formylcytidine，5frC）和5-羧胞苷（5-carboxycytidine，5carC）。TET 酶家族對多種核酸底物包括dsDNA、ssDNA、ssRNA 和DNA-RNA 雜交鏈均可發揮催化作用[11]。但是對于TET 的結構和生物學功能以及如何增強TET 介導的氧化特異性和選擇性等問題仍有待深入研究。

1.3 m5C 甲基化結合蛋白

RNA 修飾發揮的生物學功能主要與其結合蛋白相關。m5C 甲基化結合蛋白主要有ALYREF（ Aly/REF export factor） 和YBX1 （ Y-box binding protein 1）。ALYREF 是mRNA 轉運蛋白復合體TREX 的主要組成部分。在mRNA 出核過程中，ALYREF 首先被募集，在CBP80 介導下與mRNA的5'端結合，在PABPN1 介導下與mRNA 的3'末端結合；ALYREF 還通過與3'端加工因子CstF64 直接作用，進一步加強ALYREF 和mRNA 的結合。在人HeLa 細胞和小鼠組織中，ALYREF 直接與mRNA m5C 位點結合，促進mRNA 核-質穿梭，而mRNAALYREF 的結合親和力以及出核過程均由NSUN2介導。YBX1 是一種新發現的m5C 結合蛋白，YBX1可調節細胞質中mRNA 的穩定性。在膀胱癌中，YBX1 通過其冷休克結構域（cold-shock domain，CDS）中W65 位吲哚環識別m5C 修飾的mRNA 并與之結合，通過募集YBX1 互作因子（ELAV-like protein 1，ELAVL1），YBX1 可穩定m5C 修飾的mRNA 從而調節mRNA 代謝。在肺癌中，YBX1 通過與lncRNA LINC00312 直接結合促進腫瘤細胞的侵襲、遷移和血管生成[12]。目前研究并發表的m5C 甲基化結合蛋白僅有ALYREF 和YBX1，其他甲基化結合蛋白仍待發現和驗證，其對于RNA m5C 修飾的調控機制亦待進一步研究。

2 m5C 甲基化修飾對RNA 的影響

2.1 m5C 甲基化修飾對mRNA 的影響

mRNA 中存在大量的m5C 甲基化修飾，m5C 甲基化修飾對mRNA 功能的影響是近年來的研究熱點。1）m5C 甲基化修飾影響mRNA 的翻譯。近期研究表明[13]m5C 修飾與mRNA 翻譯之間存在功能上的相互依賴性。在HeLa 細胞中，編碼區的m5C 位點與mRNA 的翻譯效率呈負相關。而另一項研究表明[14]，NSUN2 誘導的m5C 甲基化與METTL3/METTL14誘導的m6A 甲基化協同作用，介導p21 mRNA 3'-UTR（untranslated region）甲基化，增強p21 mRNA 的翻譯效率。近期亦有研究發現[15]mRNA 編碼區m5C修飾與翻譯效率呈負相關，而3'-UTR 中的m5C 甲基化修飾與翻譯效率則呈正相關；2）m5C 甲基化修飾影響mRNA 的轉運。研究表明[16]m5C 修飾在富含CG堿基的區域及緊鄰起始密碼子下游富集，并在mRNA出核中發揮關鍵作用；3）m5C 甲基化修飾影響mRNA的穩定性。在膀胱癌中，YBX1 通過招募ELAVL1 增強m5C 修飾的mRNA 穩定性[3]。有研究發現[17]m5C修飾水平與mRNA 穩定性無關或呈負相關。因此，m5C 甲基化修飾對mRNA 穩定性的影響仍需進一步研究。

2.2 m5C 甲基化修飾對tRNA 的影響

m5C 甲基化修飾調節tRNA 的穩定性，調節細胞代謝，參與細胞應激。研究表明，NSUN2 和DNMT2介導的tRNA m5C 修飾可維持tRNA 穩定性并調節細胞代謝[13,17]。在人、小鼠和植物中，TRM4/NSUN2 介導的m5C 甲基化可防止tRNA 因氧化應激而降解。DNMT2 介導的tRNA 甲基化可保護其免受核酸內切酶作用，調節底物tRNAAsp-GTC和tRNAGly-GCC的穩定性。

2.3 m5C 甲基化修飾對rRNA 的影響

m5C 甲基化修飾調節rRNA 的穩定性，影響核糖體合成。在小亞基12S rRNA 中，m5C甲基轉移酶NSUN4可使胞嘧啶911 甲基化（m5C911），并與MTERF4 形成復合體，確保僅有成熟大亞基和小亞基組裝形成復合體。m5C2278 與G2288 甲基化缺失導致25S rRNA 結構變化。當細胞暴露于過氧化氫時，Rcm1/NSUN5 的缺失會導致25S rRNA C2278 附近序列折疊更松散，說明Rcm1/NSUN5 在氧化應激條件下對維持rRNA 的穩定發揮重要作用。

2.4 m5C 甲基化修飾對其他RNA 的影響

m5C 甲基化修飾對病毒RNA、lncRNA、環狀RNA（circular RNA，circRNA）等也具有重要作用。病毒RNA 中存在大量m5C 甲基化修飾。研究表明DNMT2 介導的m5C 甲基化可穩定HIV-1 基因組RNA，保障其在宿主細胞中存活[18]。然而近期亦有研究發現m5C 修飾對病毒RNA 復制和穩定性有負面影響。NSUN1 與HIV-1 Tat 蛋白競爭催化HIV-1 TAR RNA5'-UTR 的甲基化，從而抑制了HIV-1 復制并促使其進入潛伏狀態[19]。非編碼RNA、lncRNA 和circRNA 中也存在大量的m5C修飾。LncRNA HOTAIR和XIST 染色質修飾復合物相互作用區或其附近的m5C 甲基化，可通過影響XIST 與染色質相關蛋白復合物PRC2 的結合來影響XIST 功能。在肝癌組織中lncRNA 和circRNA m5C 甲基化頻率和甲基化基因的數量也顯著多于癌旁組織，提示m5C 修飾在肝癌發生發展中可能發揮重要作用[1-2]。綜上所述，m5C 修飾在多種RNA 中廣泛存在且可能發揮重要功能。目前，m5C 修飾對RNA 的影響研究還比較少，對其認知尚存爭議，仍有待進一步研究。

3 RNA m5C 修飾在腫瘤中的研究進展

3.1 m5C 甲基化修飾與肝癌

通過對比肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）及癌旁組織發現，HCC 中mRNA m5C 峰明顯多于癌旁組織，且分布更為廣泛[4]。除了編碼RNA，HCC 組織中circRNA 和lncRNA m5C 甲基化頻率和甲基化基因的數量也顯著多于癌旁組織[1，2]。RNA m5C 修飾促進HCC 進展，m5C 調節因子NSUN4 和ALYREF 的升高與HCC 患者的不良預后負相關[20]。近期研究發現，在肝癌細胞HepG2 中，NSUN2 缺失抑制細胞的增殖及遷移[8]。轉錄組測序及亞硫酸鹽測序（bisulfite sequencing，Bis-Seq）發現NSUN2 缺 失 后lncRNA H19 m5C 甲基化和基因表達顯著降低。機制研究發現，lncRNA H19 是NSUN2 RNA 甲基修飾酶的特異靶點，m5C 修飾影響H19 的半衰期與穩定性，m5C 修飾的H19 可通過特異結合G3BP1 腫瘤蛋白促進腫瘤的發生和發展[8]。

3.2 m5C 甲基化修飾與膀胱癌

在膀胱癌中，癌組織和癌旁組織RNA Bis-Seq 發現在膀胱癌中存在高頻m5C 甲基化，大多數m5C 甲基化位點存在于mRNA 中，且高甲基化mRNA 在致癌通路中顯著富集。進一步研究表明，膀胱癌組織中NSUN2 和YBX1 表達異常升高，原癌基因肝素結合生長因子（heparin binding growth factor，HDGF） mRNA被NSUN2 甲基化，YBX1 通過與HDGF mRNAm5C甲基化位點結合并募集ELAVL1，維持HDGF mRNA穩定性，促進腫瘤發生。

3.3 m5C 甲基化修飾與胃腸癌

研究表明與癌旁組織相比，NSUN2 在胃癌中上調表達。體內外實驗證實NSUN2 促進胃癌細胞的增殖及腫瘤發生。RNA 測序發現在胃癌中p57KIP2 為NSUN2 調控的下游靶標。機制上，NSUN2 的甲基轉移酶活性及p57Kip2 mRNA 3'-UTR 區m5C 修飾破壞了p57Kip2 mRNA 的穩定性，從而促進胃癌發生[21]。m5C 甲基轉移酶和結合蛋白在胃腸癌中表達上調，其高表達與患者生存率低顯著相關。生物信息學分析發現，m5C 調節蛋白與ErbB/PI3K-Akt 信號通路密切相關，GSK3B 是m5C 調節蛋白的重要靶點[22]。

3.4 m5C 甲基化修飾與白血病

在白血病中，NSUN1 特異性與BRD4 相互作用，直接與RNA 聚合酶Ⅱ（RNA polymerase Ⅱ，RNA-pol-Ⅱ）CTD-S2P 結合，在5-氮雜胞苷（5-azacytidine，5-AZA）耐藥的白血病細胞中形成獨特的NSUN1/BRD4/RNA-pol-Ⅱ CTD-S2P 復合物，從而介導5-AZA抗性染色質結構的形成，造成白血病中的5-AZA 抵抗。而NSUN3 和DNMT2 則對5-AZA 敏感的白血病細胞表現出相反作用。在機制上，RNA 結合蛋白hnRNPK直接與m5C 甲基化轉移酶NSUN3 和DNMT2、譜系決定轉錄因子GATA1 和SPI1/PU.1 以及CDK9/PTEFb 相互作用，并在新生RNA 處募集RNA-pol-Ⅱ形成獨特的復合物，最終形成對5-AZA 敏感的染色質結構。比較5-AZA 耐藥和5-AZA 敏感的白血病病骨髓樣本發現，5-AZA 耐藥的骨髓中m5C mRNA 明顯高于5-AZA 敏感的骨髓樣本。hnRNPK、NSUN1和BRD4 的表達水平與白血病病程相關，并參與5-AZA 耐藥及腫瘤進展[23]。

3.5 m5C 甲基化修飾與膠質瘤

在膠質瘤中，不同臨床病理特征的腫瘤RNA m5C 甲基轉移酶表達不同。利用5 種m5C 甲基轉移酶基因構建風險預測模型可以預測膠質瘤患者生存率及臨床病理特征，Cox 回歸分析結果顯示模型預測風險評分是膠質瘤獨立預后因素[6]。此外，在多形神經膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）中，大部分miRNA 存在m5C 修飾， miRNA-181a-5p 甲基化修飾與GBM 患者的不良預后相關。機制上，經含DNMT3a 和AGO4 的復合物介導，miR-181a-5p 的m5C 甲基化修飾抑制miRNA-181a-5p/mRNA 雙鏈的形成，導致其抑癌作用喪失[24]。

3.6 m5C 甲基化修飾與肺癌

在肺腺癌中，基于11 個m5C 調控因子，劃分了兩種m5C 甲基化修飾模式，其具有不同的腫瘤微環境免疫細胞浸潤特征；建立m5C 甲基化修飾評分體系，結果表明在高評分組肺腺癌患者預后較好，而m5C 低評分組預后較差[25]。基于14 個m5C 相關的lncRNA 構建肺腺癌患者預后預測模型，結果顯示高危組預后較低危組差，具有較高敏感性和特異性[26]。在肺鱗狀細胞癌中，與正常肺組織相比，m5C 甲基化調控因子NSUN3、NSUN4 高表達，與患者預后不良相關[27]。

4 結語與展望

綜上所述，編碼RNA 及非編碼RNA m5C 甲基化修飾參與了腫瘤的發生發展、侵襲轉移、腫瘤耐藥等進程。RNA m5C 修飾及m5C 調節因子在作為腫瘤診斷和（或）預后判斷的標志物中也顯示出了巨大的潛力。對RNA m5C 修飾的靶向干預也可能為腫瘤的治療開辟新的方向。盡管如此，對RNA m5C 甲基化修飾的影響及調節機制的研究仍較淺顯，m5C 甲基化修飾在腫瘤中的研究尚處于起步階段，機制解析相關研究較少，研究涉及的腫瘤類型亦不夠全面，上述問題均有待于進一步研究探索。