膜聯(lián)蛋白B1在豬囊尾蚴免疫逃避作用的研究進(jìn)展

于銘川，王昕蕊，宋偉宜，宋伊寧，楊景芳，孫樹民

（1內(nèi)蒙古民族大學(xué)動物科技學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼028000；2內(nèi)蒙古通遼市家畜繁育指導(dǎo)站，內(nèi)蒙古通遼028000）

0 引言

豬囊尾蚴病(Porcine cysticercosis)是由豬帶絳蟲(Taenia solium)的幼蟲（囊尾蚴）寄生于人、畜組織或器官內(nèi)而引起的一種人獸共患寄生蟲病，該病2010被世界衛(wèi)生組織列為重點研究和控制的17種易被忽視的熱 帶 疾 病 (Neglected tropical diseases,NTDs)之 一[1]。囊尾蚴病呈世界性分布，特別在拉丁美洲，非洲，亞洲等發(fā)展中國家流行廣泛，直到今日仍被認(rèn)為是一種引發(fā)重要公共衛(wèi)生事件的疾病。寄生現(xiàn)象是宿主和寄生蟲建立的生物學(xué)和免疫學(xué)上互作關(guān)系。適應(yīng)宿主環(huán)境是寄生蟲成功寄生的前提，寄生蟲主動免疫逃避和免疫抑制是成功寄生的關(guān)鍵因素，豬囊尾蚴與其他寄生性蠕蟲相似，依賴其抗原或衍生物逃避或抑制宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，從而達(dá)到成功寄生的目的。寄生蟲抗原與宿主免疫系統(tǒng)互相作用究其根源是抗原蛋白與宿主免疫系統(tǒng)的作用，研究蟲體囊液蛋白對探討免疫逃避或免疫抑制具有重要意義。作為抗原重要家族成員的膜聯(lián)蛋白(Annexin,ANX)，在細(xì)胞骨架活動，細(xì)胞膜磷酸化、膜受體調(diào)節(jié)、有絲分裂中發(fā)揮重要的功能[2-3]，其家族成員在細(xì)胞癌變、自身免疫類疾病、抗炎癥、抗凝血等機制和通路有重要的研究和應(yīng)用價值[4-6]。其中ANX B1在蟲體侵入過程中對宿主的免疫系統(tǒng)干擾和影響發(fā)揮重要作用，特別是在蟲體免疫逃避中的作用。因此，探討蟲體囊液中膜聯(lián)蛋白與宿主機體互相作用，為囊尾蚴入侵機制和早（中）期阻斷該病提供新思路。

1 豬囊尾蚴病流行與危害

豬囊尾蚴是一種多細(xì)胞、無脊椎的真核寄生蟲性蠕蟲，自中國文獻(xiàn)記載白蟲開始距今1800多年的歷史，該病不但給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失，而且危害人類的健康，嚴(yán)重的甚至導(dǎo)致死亡。豬帶絳蟲囊尾蚴病在世界范圍內(nèi)均有發(fā)生，主要流行于拉美，撒哈拉以南的非洲國家和亞洲大部分地區(qū)。全球現(xiàn)有約5000萬人感染帶狀絳蟲，其中絕大多數(shù)是由豬帶絳蟲所引起。據(jù)現(xiàn)有癲癇患病數(shù)據(jù)估計，患腦囊尾蚴病（包括有癥狀和無癥狀病人）的總?cè)藬?shù)介于256萬～830萬之間，每年全球因腦囊尾蚴病死亡病人超過5萬人[7]。近年囊尾蚴病流行范圍已擴展到許多發(fā)達(dá)國家，在北美國、歐洲和澳大利亞等國家已連續(xù)多年均有報道[8-9]。最新統(tǒng)計顯示，中國人豬帶絳蟲囊尾蚴病血清陽性率為0.58%，根據(jù)流行感染率推算中國囊尾蚴病患者大約在30萬～70萬人[10]。中國每年豬囊尾蚴感染豬肉和屠宰豬檢驗費所造成直接經(jīng)濟損失達(dá)上百億元人民幣。另外，用于治療帶絳蟲病人（按55萬患者計算）總費用為313億元，而造成間接的經(jīng)濟損失很難用數(shù)據(jù)來評價。鑒于其流行及其危害性，豬囊尾蚴病被世界各國規(guī)定為強檢必檢病種，目前已成為危害最嚴(yán)重食源性寄生蟲病。導(dǎo)致該病仍然流行和危害嚴(yán)重最主要原因為致病機制尚不明確。

2 膜聯(lián)蛋白分類

2.1 膜聯(lián)蛋白的作用

依照基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)化關(guān)系以及在染色體上的定位不同，膜聯(lián)蛋白可以分為5個大類：A類脊椎動物膜聯(lián)蛋白、B類無脊椎動物膜聯(lián)蛋白、C類真菌和單細(xì)胞真核生物膜聯(lián)蛋白、D類植物膜聯(lián)蛋白和E類原生生物膜聯(lián)蛋白[11-12]。膜聯(lián)蛋白家族是一類進(jìn)化上高度保守的蛋白家族[13]，依賴鈣離子的磷脂結(jié)合，靜息狀態(tài)下主要存在細(xì)胞質(zhì)中[14-15]。膜聯(lián)蛋白也是一種有效的內(nèi)源性免疫調(diào)節(jié)蛋白，參與了癌癥中必需的多種功能，包括細(xì)胞增殖、凋亡、化療敏感性、抗凝血抗炎反應(yīng)、胞吞胞吐、轉(zhuǎn)移，和入侵[16]。研究表明，膜聯(lián)蛋白A1能激活抑制炎癥的自然通路，而無當(dāng)前抗炎藥物的副作用，比目前的消炎藥物更安全，通過進(jìn)一步研究有望成為抗炎治療的新策略[17-18]。膜聯(lián)蛋白A2在自身免疫疾病患者中高表達(dá)，其通路包括，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，介導(dǎo)信號通路的激活從而誘導(dǎo)炎性因子的分泌，有望成為治療自身免疫性疾病新的治療靶點[19-20]；并且A2在病毒感染致病過程中，促進(jìn)病毒復(fù)制，并且與其他蛋白互作對細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)，為預(yù)防和治療病毒提供理論依據(jù)[21]。膜聯(lián)蛋白A3在消化系統(tǒng)癌癥患者中，表達(dá)量增加使腫瘤體積變大，在患癌早期促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，和侵襲。Tong等[22]開發(fā)針對膜聯(lián)蛋白A3特異性單克隆抗體（抗AnnexinA3mAb）能有效阻斷膜聯(lián)蛋白A3，促進(jìn)細(xì)胞凋亡增加，為臨床診斷和開發(fā)新藥提供更多可能。膜聯(lián)蛋白A4通過抑制外源性細(xì)胞凋亡通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)肝臟胰腺細(xì)胞的凋亡及肝臟腫瘤細(xì)胞化療藥物抵抗[23]。膜聯(lián)蛋白A5與磷脂酰絲氨酸高度特異性結(jié)合的特性已經(jīng)被用于分子探針和藥物的載體開發(fā)，結(jié)合流式細(xì)胞分析技術(shù)后成為當(dāng)下體外檢測細(xì)胞凋亡的理想分子探針，獲得廣泛關(guān)注和應(yīng)用[24-25]。

現(xiàn)有研究證明，膜聯(lián)蛋白的表達(dá)在不同惡性腫瘤的正負(fù)相關(guān)性存在著差異。在包括胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌、膽囊癌、胰腺癌等消化道惡性腫瘤以及肺腺癌、乳腺癌中，膜聯(lián)蛋白的高表達(dá)發(fā)揮促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用；而在前列腺癌中則相反。更重要的是，膜聯(lián)蛋白的異常表達(dá)往往與多種惡性腫瘤的臨床分期及不良預(yù)后相關(guān)，這使其可作為一個潛在的生物學(xué)檢測指標(biāo)和治療靶標(biāo)來為腫瘤患者的診斷及治療提供更多可能[26]。

2.2 膜聯(lián)蛋白的結(jié)構(gòu)

膜聯(lián)蛋白是一種略微彎曲的蛋白質(zhì)，有一個凸面和一個凹面。人ANX基因的大小范圍從15 kb(ANXA9)到 96 kb(ANXA10)，位于 15號染色體q21～q22，由339個氨基酸組成[27]。它由一個高度保守的核心結(jié)構(gòu)域（由4個70～80個氨基酸的同源重復(fù)序列組成，稱為膜聯(lián)蛋白重復(fù)序列）C端和一個獨特的由30個氨基酸組成的長N端的“頭部結(jié)構(gòu)域”（在一些文獻(xiàn)中也稱為尾部結(jié)構(gòu)域或N-端相互作用結(jié)構(gòu)域）組成，其結(jié)構(gòu)上核心序列一致,分別位于45～58、117～130、216～233、291～304位氨基酸的三級結(jié)構(gòu)特點,包含18個α螺旋,其余大部分為無規(guī)卷曲（占33%）；相對分子質(zhì)量為37584，等電點為5.94。分子結(jié)構(gòu)呈扁平桶狀,桶壁由4個結(jié)構(gòu)相似的結(jié)構(gòu)域(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)組成，每個結(jié)構(gòu)域包含5個螺旋(A、B、C、D、E),以右手超螺旋的形式折疊；結(jié)構(gòu)域的第1和第2個α螺旋的連接部位為一個突出的環(huán)，由G、T、K、L、S、I等氨基酸組成的Ca2+結(jié)合的位點，其結(jié)構(gòu)特點如下圖一。分析顯示膜聯(lián)蛋白B1具有膜聯(lián)蛋白A1和膜聯(lián)蛋白A5的相似結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)，除了其抗炎、抗凝血功能，膜聯(lián)蛋白B1特有的氨基酸序列與囊尾蚴寄生的種屬特異性和組織特異性有關(guān)[28]。可調(diào)節(jié)膜聯(lián)蛋白與蛋白配體間相互作用和膜聯(lián)蛋白與膜的相關(guān)性,是區(qū)分不同亞家族的主要依據(jù)[29-30]。其生生物學(xué)特征有兩方面，一是具有Ca2+依賴性，膜聯(lián)蛋白只有在Ca2+存在情況下才能與磷脂膜結(jié)合；二是這種結(jié)合是可逆的，去除Ca2+后，膜聯(lián)蛋白就與磷脂分開[31]。膜聯(lián)蛋白B1核心結(jié)構(gòu)域在Ca2+依賴的膜相互作用中對Ca2+的敏感性有細(xì)微的不同。因此，不同的膜聯(lián)蛋白在細(xì)胞中可能具有不同的功能[32]。

3 豬囊尾蚴中膜聯(lián)蛋白介導(dǎo)免疫逃避

寄生性蠕蟲的膜聯(lián)蛋白是較早被鑒定能參加免疫抑制的蛋白家族成員，參與多種生理和細(xì)胞的功能。膜聯(lián)蛋白目前在原蟲[33]、線蟲[34]、血吸蟲[35]和蠕蟲[36]均有研究，其研究主要涉及蛋白結(jié)構(gòu)分析和體內(nèi)外功能驗證以及在通路機制上的干預(yù)為主，是否參與免疫逃避的確證闡述較少或多為推測，尚未對膜聯(lián)蛋白介導(dǎo)免疫逃避分子機制進(jìn)行闡述，特別是豬帶絳蟲囊尾蚴感染過程中膜聯(lián)蛋白的功能研究較少，多為基因或蛋白結(jié)構(gòu)性分析和功能推測，其介導(dǎo)的免疫逃避分子機制研究未被廣泛涉及。眾多學(xué)者推測豬囊蟲存在的膜聯(lián)蛋白具有抑制或調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性的作用，通過宿主免疫球蛋白掩蔽囊尾蚴抗原，從而逃避宿主免疫追蹤，因此囊尾蚴囊液中已被證明含有IgG、IgM、IgA和IgE，寄生蟲控制天然免疫的另一個關(guān)鍵策略是通過釋放的抗原阻斷補體系統(tǒng)，抑制經(jīng)典和替代的補體通路達(dá)到抑制其活性的目的[37-38]。已知活囊也分泌半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和絲氨酸蛋白酶，這些蛋白酶降解宿主免疫球蛋白，干擾CD4+細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而影響B(tài)細(xì)胞產(chǎn)生抗體[39]。例如，以布氏錐蟲蟲體為代表，其蟲體表面的糖膜聯(lián)蛋白膜抗原不斷更新，致使特異性抗體很難捕獲新抗原，且一些寄生蟲感染往往誘發(fā)宿主產(chǎn)生高免疫球蛋白血癥，誘導(dǎo)B細(xì)胞激活，雖產(chǎn)生大量抗體，但卻無明顯的保護(hù)作用，至感染晚期，雖有抗原刺激，B細(xì)胞卻不能分泌抗體，說明多克隆B細(xì)胞的激活導(dǎo)致了能與抗原反應(yīng)的特異性B細(xì)胞的耗竭，抑制宿主的免疫應(yīng)答，甚至出現(xiàn)繼發(fā)性免疫缺陷[40]。豬囊尾蚴之所以能夠在宿主體內(nèi)長期寄生一方面通過抗原的變異來逃避宿主免疫攻擊，另一方面通過分泌型蛋白干擾宿主識別從而調(diào)節(jié)或逃逸宿主的免疫反應(yīng)達(dá)到寄生目的。因此這類囊液中的分泌型蛋白是研究和分析囊尾蚴侵襲和寄生機制的重要手段。研究初步發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白存在于囊液細(xì)胞及細(xì)胞組分中，具有脂質(zhì)結(jié)合和離子結(jié)合功能，參與一系列依賴鈣離子的模型生物活動，所以鑒于囊尾蚴囊液中膜聯(lián)蛋白的表現(xiàn)出在寄生蟲入侵機體中的作用，對其免疫逃避機制的探究顯得尤為重要。作為膜聯(lián)蛋白家族成員膜聯(lián)蛋白B1（GenBank登錄號：AF147955）誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡可能是一種防止宿主免疫攻擊的新策略，膜聯(lián)蛋白B1依賴性蛋白激酶的氨基酸序列具有較高的特異性，為豬囊尾蚴病特異性診斷方法的建立提供了可能[41]。

圖1 膜聯(lián)蛋白B1蛋白的結(jié)構(gòu)（SWISS-MODEL數(shù)據(jù)庫）

4 膜聯(lián)蛋白B1 在豬囊尾蚴免疫逃避中的作用

近些年研究膜聯(lián)蛋白被認(rèn)為具有廣泛的重要生物學(xué)作用，其蛋白量占囊尾蚴總蛋白的2%～3%，提示它可能在豬囊尾蚴的生活史中起重要作用[42]。如膜運輸和融合，Ca2+通道活性，抑制蛋白激酶C，抗炎活性，作為細(xì)胞凋亡探針或者抗原抗體的特異性結(jié)合來誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡來逃避宿主的免疫攻擊等。膜聯(lián)蛋白B1在豬囊尾蚴中具有階段特異性表達(dá)，另外該蛋白在中間宿主中用作囊蟲病疫苗時是非常有效的，因此很容易推測，膜聯(lián)蛋白B1在寄生蟲幼蟲期的高表達(dá)可能與這種抗原誘導(dǎo)對感染的保護(hù)能力有關(guān)。這種高表達(dá)可能對寄生蟲有其他意義，例如維持宿主-寄生蟲的平衡，使寄生蟲能夠在宿主中長時間存活，在許多情況下可伴隨宿主存活數(shù)年。在囊尾蚴的囊液中以及囊蟲病豬和人的血清中都檢測到了膜聯(lián)蛋白B1；免疫化學(xué)分析顯示，囊尾蚴可以通過主動逃避和抑制免疫而導(dǎo)致無癥狀的感染[43-44]；組織學(xué)研究表明，在人和豬中，活的囊尾蚴周圍的組織很少或沒有的炎癥，然而宿主-寄生蟲平衡被打破，一個或多個退行性囊腫周圍的免疫介導(dǎo)的炎癥可以演變成囊蟲病。膜聯(lián)蛋白B1存在于周圍的宿主衍生層中，參與囊尾蚴形成包囊[45]。這些寄生蟲已經(jīng)發(fā)展出復(fù)雜的機制，從而能夠在宿主的組織中持續(xù)存在。囊尾蚴在宿主中的不均勻分布及其與囊腫形成或包囊的關(guān)系的性質(zhì)可能有助于隔離寄生蟲，使其免受免疫攻擊。雖然尚未得到充分的證實，但由囊尾蚴分泌的活性因子誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞凋亡可能是參與免疫逃避的機制之一。

嗜酸性粒細(xì)胞在囊尾蚴感染的免疫反應(yīng)中也具有重要作用。體外試驗表明，這些細(xì)胞具有損傷或殺死寄生蟲幼蟲的能力，主要是通過使用抗體依賴的細(xì)胞毒性機制。另一方面，絳蟲感染是一種慢性疾病，這意味著這類寄生蟲制定了避免或防止宿主免疫攻擊的策略，因此，分泌的膜聯(lián)蛋白B1與嗜酸性粒細(xì)胞共存的實驗觀察表明，膜聯(lián)蛋白B1可能在寄生蟲的免疫逃避中起作用[46]。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，膜聯(lián)蛋白B1與嗜酸性粒細(xì)胞的結(jié)合是Ca2+依賴性的，預(yù)先負(fù)載鈣通道阻斷劑可抑制膜聯(lián)蛋白B1誘導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流，相同濃度的膜聯(lián)蛋白對嗜酸性粒細(xì)胞凋亡作用隨著時間、濃度的增加都存在顯著差異，也就是說膜聯(lián)蛋白B1誘導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞凋亡具有時間和濃度依賴性，易被負(fù)載鈣通道阻斷劑抑制，從而達(dá)到抵御宿主防御感染的目的[47-48]。

膜聯(lián)蛋白某些家族蛋白已經(jīng)證明也是糖皮質(zhì)激素抗炎作用的重要介質(zhì)。地塞米松作為一種合成的糖皮質(zhì)激素，增加Ca2+并誘導(dǎo)膜聯(lián)蛋白B1的表達(dá)和分泌。當(dāng)用地塞米松刺激細(xì)胞時，膜聯(lián)蛋白被外化到質(zhì)膜的外表面，而當(dāng)細(xì)胞預(yù)先被負(fù)載鈣通道阻斷劑抑制時，膜聯(lián)蛋白的分泌被完全阻斷[49]。然而當(dāng)Ca2+的離子載體增加時，沒有觀察到膜聯(lián)蛋白B1的分泌。因此這說明增加Ca2+的濃度對膜聯(lián)蛋白B1的分泌是必要的，但不夠充分。除了鈣依賴的這個通路外，地塞米松還激活了允許分泌膜聯(lián)蛋白B1的其他細(xì)胞內(nèi)過程，這一過程將誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡中起作用，這將有助于降低宿主的免疫應(yīng)答，促進(jìn)寄生蟲的生存，這一途徑還有待進(jìn)一步研究[50]。

5 展望

囊蟲病在世界范圍內(nèi)仍然流行，究其根源為蟲體的侵入后宿主免疫學(xué)機制是多樣復(fù)雜的，這些因素包括寄生蟲的數(shù)量、位置、大小和發(fā)育階段，以及與宿主有關(guān)的因素，這些因素可以影響疾病表現(xiàn)的過程和嚴(yán)重程度來體現(xiàn)。盡管研究者已經(jīng)證實一些囊尾蚴感染存在逃避宿主免疫攻擊機制，也推測了囊尾蚴成功感染可能通過自身調(diào)節(jié)，抑制宿主免疫，引起免疫耐受等作用逃避宿主的免疫攻擊，但囊尾蚴與宿主免疫之間復(fù)雜的相互作用，還有很多科學(xué)問題函待解決，如酶和抑制劑作用的確證、蛋白相互作用的確證等。膜聯(lián)蛋白是一個廣泛存在的蛋白家族，所有真核基因組中廣泛表達(dá)并穩(wěn)定，而且它在絳蟲的生理活動中起著重要的作用。但是，膜聯(lián)蛋白在生物學(xué)特性和生理功能方面表現(xiàn)出非常復(fù)雜的關(guān)系，迄今為止，研究者還有許多科學(xué)問題尚未闡明（如何與細(xì)胞外基質(zhì)作用；是否參與蟲體的糖代謝）等。深入開展膜聯(lián)蛋白家族成員的研究，豐富囊蟲病侵入機制特別是免疫逃避機制的理論，同時，對探尋藥物作用靶點阻斷該病流行具有重要的意義。