內(nèi)蓋夫西門坎菌的研究現(xiàn)狀與展望

盧思敏，袁 帥，吳移謀

1993年內(nèi)蓋夫西門坎菌(Simkanianegevensis, Sn)作為細胞培養(yǎng)污染物首次被發(fā)現(xiàn)。與衣原體一致，Sn亦為專性胞內(nèi)寄生菌，具有獨特的二相性發(fā)育周期。大量研究表明Sn與嬰兒細支氣管炎[1]、成人社區(qū)獲得性肺炎(community acquired pneumonia, CAP)[2]和慢性阻塞性肺疾病急性加重(Acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease, AECOPD)[3]等呼吸道疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，于1999年被正式命名。西門坎菌科主要包括西門坎菌屬(Simkania)、弗里契菌屬(CandidatusFritschea)和海龍原體屬(CandidatusSyngnamydia)3個屬[4]。西門坎菌屬目前僅有Sn一個菌種，模式株ATCC VR1471亦稱為ZT株。本文對Sn的生物學(xué)特征、致病性和致病機制以及實驗室診斷的研究現(xiàn)狀進行綜述。

1 生物學(xué)特征

1.1形態(tài)與結(jié)構(gòu) Sn在宿主細胞內(nèi)生長繁殖，具有獨特的二相性發(fā)育周期，可觀察到兩種主要形態(tài)結(jié)構(gòu)：一種形態(tài)小而致密，直徑為0.2～0.3 μm，存在于胞外環(huán)境中，具有感染能力，類似于衣原體的原體(Elementary body, EB)；另一種形態(tài)大而疏松，直徑為0.3～0.7 μm，位于胞內(nèi)，以二分裂方式繁殖，類似于衣原體的網(wǎng)狀體(Reticulate body, RB)。與其它衣原體不同的是，Sn的EB顆粒除有擬核區(qū)域外，還有電子透明區(qū)域的存在；其RB形態(tài)多樣，且可能具有類似于EB的感染能力[5]。

與其它衣原體菌株相比，Sn在含病原菌的囊泡結(jié)構(gòu)上也存在很大差異。西門坎菌囊泡(Simkania-containing vacuole, SnCV)是一種單個網(wǎng)狀液泡系統(tǒng)，與宿主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、吞噬溶酶體等細胞器相互作用影響自身的生長與發(fā)育[6-7]。有趣的是，在感染早期SnCV表面可檢測到自噬標記物LC3的存在，但隨著感染持續(xù)，SnCV表面的LC3逐漸消失，相關(guān)機制有待進一步闡述[6]。此外，Herweg等對SnCV的蛋白組成進行分析時發(fā)現(xiàn)SnCV在Sn營養(yǎng)獲取過程中發(fā)揮重要作用[8]。

1.2培養(yǎng)特性 Sn對多種細胞敏感，可在各種細胞系中繁殖，如BGM、HeLa、Vero、McCoy、HL和人成纖維細胞等。提高培養(yǎng)基中胎牛血清濃度、在培養(yǎng)基中加入放線菌酮以及使用二乙氨基-葡聚糖(DEAE-dextran)或聚乙烯二醇等化學(xué)制劑預(yù)處理宿主細胞等常規(guī)用來提高衣原體感染率的處理均不利于Sn的增殖。將接種有Sn的Vero細胞在35 ℃、1 500 g條件下離心60 min后培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基是目前研究者推薦的相對有效的培養(yǎng)方法。此外，在分離培養(yǎng)臨床樣本中的Sn時應(yīng)注意在培養(yǎng)基中添加100 μg/mL的鏈霉素和萬古霉素[9]。Sn在Vero細胞中生長緩慢，生長周期大約12～15 d，顯著長于其它衣原體典型菌株的周期。生長曲線顯示，Sn在感染細胞后的2～4 d呈對數(shù)生長，隨后進入穩(wěn)定期。與衣原體不同，Sn似乎并不以誘導(dǎo)細胞裂解的方式釋放子代，可以檢測到Sn感染性子代數(shù)量不斷增加，卻未觀察到子代感染鄰近細胞的現(xiàn)象，其相關(guān)機制還需進一步深入研究[5, 10]。

1.3生化特征 衣原體是一類嚴格真核細胞內(nèi)寄生的原核細胞型微生物，需依賴宿主細胞的營養(yǎng)和能量來合成自身高分子蛋白質(zhì)、核酸及低分子葉酸、賴氨酸等營養(yǎng)物質(zhì)而繁殖。然而，Sn在生化特征上與衣原體并不完全一致。

Sn含有葡萄糖激酶，能夠直接通過糖酵解途徑將葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖，從而減少對宿主細胞磷酸化葡萄糖的依賴。除進行完整的糖酵解途徑外，其菌體內(nèi)還含有三羧酸循環(huán)烏頭酸水合酶(Aconitine hydratase，AcnB)、異檸檬酸脫氫酶(Isocitrate dehydrogenase, Icd)和檸檬酸合酶(Citrate Synthase, GItA)，可通過糖酵解途徑后丙酮酸產(chǎn)生的乙酰輔酶A或富馬酸中天冬酰胺的轉(zhuǎn)化開始檸檬酸循環(huán)，獨立產(chǎn)生NADH和ATP。與其它衣原體相似，Sn無法從頭合成核苷酸，必須依賴核苷酸轉(zhuǎn)運蛋白從宿主攝取核苷酸。目前，已經(jīng)在Sn中鑒定出4種核苷酸轉(zhuǎn)運蛋白亞型：SnSTT1(一種ADP/ATP反向轉(zhuǎn)運蛋白)、SnSTT2(一種鳥嘌呤/ATP/H+共運輸體)、SnSTT3(一種三磷酸核苷酸逆向轉(zhuǎn)運蛋白)和SnSTT4(功能未知)。此外，Sn具有較為完整的氨基酸、葉酸合成途徑。色氨酸是衣原體發(fā)育的重要調(diào)控因子，宿主固有免疫應(yīng)答可通過干擾素γ(Interferon-γ，IFN-γ)誘導(dǎo)色氨酸降解從而抑制衣原體生長，使其進入一種“暫停發(fā)育”狀態(tài)。除能合成酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸外，Sn還擁有完整的色氨酸操縱子(tryptophan operon, trp)。因此，Sn對IFN-γ的敏感性可能遠低于衣原體[4, 11]。

1.4基因組結(jié)構(gòu)與功能 作為西門坎菌屬的代表菌株，Sn首先被完成測序(NC_015713)，其基因組結(jié)構(gòu)與其它衣原體存在一定的差異性(表1)。Sn基因組全長2 496 337 bp，G+C含量為38 mol%,預(yù)測其91%的基因組為編碼序列，其中含有2 519個蛋白編碼基因、35個tRNA基因和1個rRNA操縱子，此操縱子含有3個rRNAs (5S，16S，23S)，另有一個大小為132 038 bp的質(zhì)粒。其16S rRNA編碼基因(GenBank登錄號為U68460)與衣原體同源性為83%，與立克次體同源性為73%[12]。

迄今為止，細菌中除貝納柯克斯體(Coxiellaburnetii)外，僅在Sn中檢測到了Ⅰ型內(nèi)含子的存在。該菌Ⅰ型內(nèi)含子與藻類及變形蟲的葉綠體、線粒體的23S rRNA內(nèi)含子密切相關(guān)。SnⅠ型內(nèi)含子并不是由23S rRNA剪接而來，有可能是通過基因水平轉(zhuǎn)移的方式獲得。目前，該菌Ⅰ型內(nèi)含子的具體功能還不明確，但有證據(jù)表明其可能通過抑制核糖體的功能影響菌體發(fā)育。Ⅰ型內(nèi)含子的存在可能與阿米巴蟲和植物質(zhì)體存在共同進化史[4]。

表1 幾種衣原體基因組的主要特征Tab.1 Main characteristics of several Chlamydiae genomes

1.5抗原結(jié)構(gòu) Sn與衣原體在形態(tài)上相似，但在抗原結(jié)構(gòu)上不同。Sn有大量特異性蛋白質(zhì)，但絕大多數(shù)(69%～82%)是未鑒定功能的未知蛋白質(zhì)[13]。

衣原體主要外膜蛋白(major outer membrane protein, MOMP)的二級結(jié)構(gòu)與穿孔蛋白(porin)一致，具有穿孔蛋白特性。外膜蛋白A(outer membrane protein A, OmcA)、外膜蛋白B(outer membrane protein B, OmcB)同MOMP一起構(gòu)成外膜復(fù)合物。除參與衣原體入侵外，外膜蛋白還是誘發(fā)宿主免疫應(yīng)答的主要抗原[14]。

經(jīng)蛋白組學(xué)分析，Sn外膜主要由65種外膜蛋白組成，其中，有37種外膜蛋白類似衣原體MOMP，稱為MOMP樣蛋白；有30種外膜蛋白含有β-折疊結(jié)構(gòu)，可能發(fā)揮類似穿孔蛋白樣作用。Sn中尚未檢測到OmcA、OmcB及其同系物的存在[15]。此外，Sn還存在3種多形態(tài)膜蛋白B(polymorphic membrane proteins B, PmpB)的同系物，與衣原體Pmp一樣，同系物中存在前導(dǎo)序列、C-末端自轉(zhuǎn)運蛋白域及典型的GG[A/L/V/I][I/L/V/Y]…FXXN序列，可能具有分子轉(zhuǎn)運、黏附、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或其它相關(guān)功能[16]。

2 致病性與致病機制

2.1致病性 西門坎菌是一種廣泛分布于全世界的新發(fā)衣原體。弗里契菌屬中已鑒定的兩個弗里契衣原體種均寄生在昆蟲體內(nèi)，是煙粉虱和介殼蟲的專性共生菌；海龍原體屬則都能對魚類致病，引起魚類上皮組織囊腫[17-18]。Sn則是一種阿米巴共生體，能廣泛寄生于節(jié)肢動物、哺乳動物細胞和阿米巴蟲等各種生物[13,19]。Sn及其變異株都能感染人體，但確切的傳播途徑尚未闡明。Croxatto和Donati等研究者相繼從節(jié)肢動物蜱中擴增出了Sn DNA和在胃腸道疾病患者中檢測到了針對Sn的特異性IgA抗體，這表明人類可能通過接觸攜帶病原菌的阿米巴蟲、節(jié)肢動物或飲用被其污染的水而被感染[4]?；颊吒腥維n后出現(xiàn)高熱、干咳、白細胞計數(shù)左移和胃腸道不適等類似CAP的臨床表現(xiàn)且對紅霉素治療有反應(yīng)[2]。一項關(guān)于索羅亞醫(yī)療中心嬰兒細支氣管炎的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，參與研究的239名細支氣管炎患兒中，有25%的個體檢測到了Sn，并在15%的個體中檢測到了特異性IgA的存在，這說明Sn可能在嬰兒細支氣管炎中發(fā)揮致病作用[1]。此外，有血清學(xué)結(jié)果分析顯示，Sn還可能與AECOPD存在聯(lián)系。

體外研究證實Sn能感染各種組織來源的人類細胞培養(yǎng)物，如呼吸道上皮細胞、生殖道細胞、胃腸道細胞和內(nèi)皮細胞，并顯著黏附于呼吸道上皮細胞和生殖道細胞[20]。在培養(yǎng)細胞中Sn可引起以下3種感染：①急性感染，感染過程中感染性子代數(shù)量不斷增加并伴隨明顯的細胞病變效應(yīng)和炎癥因子分泌。②持續(xù)性感染，其發(fā)生可能與Sn抑制細胞凋亡和缺乏誘導(dǎo)細胞裂解的能力密切相關(guān)。感染過程伴隨著炎癥因子分泌，但尚未引起明顯的細胞病變效應(yīng)。持續(xù)性感染細胞與巨噬細胞型細胞共培養(yǎng)后可轉(zhuǎn)化為急性感染。③潛伏性感染，該種感染可能由鐵降解誘導(dǎo)產(chǎn)生，在感染過程中沒有引起感染性子代數(shù)量增加和明顯的細胞病變效應(yīng)，但能檢測到Sn DNA的存在和炎癥因子分泌。在連續(xù)性胰蛋白酶處理后，潛伏性感染可轉(zhuǎn)化為急性感染[4, 20]。

2.2致病機制 Sn質(zhì)粒(PSn)是目前已知衣原體質(zhì)粒中最大的質(zhì)粒，與編碼138種預(yù)測蛋白的F型接合質(zhì)粒高度相似[13]。Kari等[21]和Porcella等[22]分別在2011年和2015年利用該菌質(zhì)粒缺陷株進行體內(nèi)和體外感染實驗發(fā)現(xiàn)，與野生株相比，缺陷株引起的感染和炎癥反應(yīng)程度較弱，PSn有可能像衣原體質(zhì)粒一樣，在Sn致病機制中發(fā)揮重要作用。衣原體的巨噬細胞感染增強蛋白(macrophage infectivity potentiator， MIP)是一種相對分子量為27 kDa的脂蛋白，具有肽基脯氨酰順/反異構(gòu)酶(PPIase)活性，與嗜肺軍團菌表面的MIP具有較高的同源性。其中，沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis, Ct)MIP可通過TLR2/TLR1/TLR6及CD14途徑刺激感染細胞分泌IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8等促炎細胞因子，引發(fā)嚴重的炎癥反應(yīng)，加重組織損傷[23]。已經(jīng)證實，PSn能夠編碼產(chǎn)生MIP同系物，其可能通過多種途徑影響Sn與宿主細胞的相互作用過程從而促進病原體致病，但具體機制尚不明確[13]。巨噬細胞是固有免疫反應(yīng)的主要細胞，在衣原體感染人體后可通過吞噬-溶酶體途徑滅活并消化病原體[24]，但部分致病衣原體可通過多種機制逃避巨噬細胞殺傷并存活于巨噬細胞內(nèi)，如Ct可通過擠壓體的形成促進其在巨噬細胞內(nèi)的存活并增強自身感染性[25]。體外研究表明，Sn能夠在單核細胞/巨噬細胞系U937細胞中存活，且能以U937細胞作為媒介感染其它組織來源的貼壁細胞，雖然相關(guān)機制還不清楚，但這些初步實驗結(jié)果可能與Sn在體內(nèi)的感染情況相關(guān)，應(yīng)進一步研究[26]。

除PSn外，Ⅲ型分泌系統(tǒng)也可能在Sn致病過程中發(fā)揮重要作用。Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system，T3SS)是廣泛存在于動、植物致病菌中的一種蛋白質(zhì)傳輸系統(tǒng)，通過分泌效應(yīng)蛋白或?qū)⒍玖Φ鞍鬃⑷胨拗骷毎l(fā)揮致病作用。衣原體的不同發(fā)育時期，T3SS可通過發(fā)揮不同作用以營造適合衣原體寄生的微環(huán)境。如Ct TarP蛋白(Ct456)可通過調(diào)節(jié)肌動蛋白募集反應(yīng)促進EB入侵宿主細胞[27]。He等[28]通過研究表明，除影響鸚鵡熱衣原體生長發(fā)育外，T3SS還可通過活化JNK/ERK途徑誘導(dǎo)宿主細胞分泌IL-8、IL-6、TNF-α和IL-1β等促炎因子。基因組分析顯示，Sn含有與衣原體科成員均相同的T3SS編碼基因，其編碼的T3SS可能在Sn抑制宿主細胞免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，但其具體機制有待進一步闡明。

此外,Sn抑制TNF-α誘導(dǎo)細胞凋亡的能力、編碼產(chǎn)生的MOMP樣蛋白及分泌的金屬肽酶等也可能在其致病過程中發(fā)揮重要作用[10, 29]。

3 實驗室診斷

目前，針對Sn感染的檢測方法有3種，分別是病原體的分離與培養(yǎng)、血清學(xué)診斷和基因診斷。但尚未有標準方法對Sn感染進行診斷。

3.1分離與培養(yǎng) Sn不能在人工培養(yǎng)基上生長，只能寄生在活細胞內(nèi)。細胞分離培養(yǎng)是其主要的分離培養(yǎng)方法。細胞培養(yǎng)除用作Sn分離外，還可研究其繁殖過程及其對細胞的敏感性和傳染性。但細胞培養(yǎng)過程極易被痰、鼻咽拭子等標本中的其它細菌污染，其敏感性顯著低于聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction, PCR)[30]?，F(xiàn)主要采用Vero細胞分離培養(yǎng)臨床標本中的Sn。分離培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，Sn與衣原體一樣，對克林霉素、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和利福平類抗生素敏感，但對部分細胞壁抑制劑具有抵抗性，如青霉素、萬古霉素[31]。除細胞分離培養(yǎng)外，阿米巴蟲分離Sn也是一種有效分離方法。值得注意的是，雖然絕大多數(shù)阿米巴蟲都能維持新發(fā)衣原體的生長，但并非所有的阿米巴蟲都敏感于Sn。現(xiàn)主要采用棘阿米巴蟲分離樣本中的Sn。目前有研究者指出使用一種以上的棘阿米巴蟲或幾種阿米巴蟲可提高臨床樣本中衣原體的分離率[30]。

3.2血清學(xué)診斷 血清學(xué)檢測是臨床應(yīng)用最為廣泛的一種檢測方法，主要包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)、免疫過氧化物酶試驗(Immunoperoxidase assay, IPA)和微量免疫熒光試驗(Microimmunofluorescence assay, MIF)。其中，ELISA是目前檢測Sn感染最常見的血清學(xué)試驗，對Sn既往感染、近期感染以及急性感染的鑒定均具有一定意義。Friedman等[32]以梯度純化的Sn顆粒作為抗原對血清學(xué)標本進行ELISA分析后表明：ELISA對篩選Sn既往感染比較有效，但并不適用于檢測幼童血清中的IgA。與ELISA將梯度純化的Sn顆粒作為抗原進行抗體檢測不同，IPA在檢測過程中將感染細胞和未感染細胞的混合物作為抗原，在光學(xué)顯微鏡下通過比較檢測標本與陰陽對照得出結(jié)果。經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)，IPA適用于檢測任何年齡階段的血清標本[1]。MIF是衣原體感染血清學(xué)檢測的金標準，但似乎并不具備檢測Sn特異性抗體的能力。為了對比實驗室間關(guān)于Sn感染的檢測結(jié)果，通常將IgG≥1∶64判定為既往感染，IgM≥1∶32或急性期與恢復(fù)期之間IgG效價增高4倍以上判定為急性感染[30, 33]。

3.3基因診斷 隨著PCR技術(shù)的不斷發(fā)展，其在衣原體學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。Kahane[1]在1998年首次采用針對該菌16SrDNA序列的引物ZpF和ZpR擴增出了一個大小為398 bp的DNA片段。隨后，Vouga等[7]通過該菌特異性16SrRNA基因運用定量PCR技術(shù)實現(xiàn)了對該菌DNA的定量檢測，并利用引物16SF和16SR及探針擴增出一個長為125 bp的片段。除16SrDNA序列外，目前用于構(gòu)建Sn PCR引物的DNA有23S rRNA基因序列及該菌熱休克蛋白60(Heat shock protein 60，Hsp60)基因序列等[30, 34]，具體引物序列見表2。

表2 內(nèi)蓋夫西門坎菌常見PCR引物Tab.2 Common PCR Primers of Simkania negevensis

4 展 望

Sn作為一種新型衣原體，其發(fā)現(xiàn)豐富了衣原體的生態(tài)多樣性，開辟了新的研究領(lǐng)域。隨著全基因組測序的完成，人們對Sn的一般生物學(xué)特征有了初步認識。但由于標準化研究方法的缺乏，人們對Sn的致病作用知之甚少。進一步開發(fā)針對Sn研究的標準化方法、開展與已知衣原體的對比研究工作將會深化我們對Sn的了解、豐富我們對衣原體的認知，為全面開展衣原體臨床診斷和防治工作夯實基礎(chǔ)。

利益沖突：無