沙眼衣原體III型分泌系統效應蛋白研究進展

張榮榮，高 哲，賈天軍

沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis，Ct)是專性細胞內寄生的革蘭氏陰性菌，可導致人類眼部和生殖道疾病，甚至引起失明或者不孕癥[1]。所有的衣原體都具有獨特的雙相發育周期，即有感染性的原體(EB)和無感染性的始體(RB)。在接觸宿主細胞后不久，EBs內化并限制在一個小液泡內，稱為包涵體[2]。在包涵體中EBs分化為RBs，RBs經二分裂復制使包涵體不斷擴大，隨后RBs開始向EBs轉化。為了建立適應Ct復制的細胞內生態位，Ct需依賴III型分泌系統(T3SS)及T3SS效應蛋白操縱宿主細胞。T3SS是一種由20～35 種蛋白質組成的蛋白質轉運系統[3]。沙眼衣原體 T3SS橫跨包涵體膜和宿主細胞內、外膜，直接將效應蛋白分泌到宿主細胞質。一旦進入宿主細胞質，T3SS效應蛋白可與宿主細胞發生聯系，在Ct的入侵、存活和釋放等方面發揮重要作用。隨著研究技術不斷發展，人們對T3SS功能的研究日漸深入，本文就目前沙眼衣原體T3SS效應蛋白功能的研究進展進行綜述。

1 沙眼衣原體T3SS

沙眼衣原體T3SS是一種獨立的多組分分泌系統，結構復雜，其基本組成部分包括：①細胞質輔助蛋白(AC)，由一系列伴侶蛋白和調節蛋白構成，在細胞質中發揮作用；②跨越Ct內膜、周質間隙和外膜的基礎裝置蛋白，在系統中高度保守，是分泌的核心部分；③針尖復合物蛋白(NC和TC)，它們連接Ct與宿主細胞膜的空隙；④真核細胞膜上形成孔的分泌性轉運蛋白(Tr)，分泌底物通過這些孔進入宿主細胞漿[4-5]，因此T3SS被稱為“分子注射器”。T3SS不但存在于Ct中，也存在于許多革蘭氏陰性菌中，如耶爾森氏菌屬(Yersiniaspp)、沙門氏菌屬(Salmonella)、福氏志賀氏菌屬(Shigellaflexneri)、衣原體屬(chlamydia)等。但與這些蛋白分泌系統不同的是，沙眼衣原體T3SS效應基因既不位于毒力質粒上，也不排列形成致病島(PAIs)，而是分散在染色體上，分布在4個群組中并排列形成多個操縱子[6]。在感染過程中，EB一旦接觸宿主細胞，T3SS蛋白及其效應蛋白可被激活。效應蛋白是T3SS分泌的毒力蛋白，經T3SS直接被遞送到宿主細胞，調節多種細胞功能從而使Ct受益。

2 沙眼衣原體T3SS效應蛋白及功能

沙眼衣原體T3SS表達多種效應蛋白，主要分為兩個亞群：①轉運并插入包涵體膜的效應蛋白，也稱為包涵體膜蛋白(inclusion membrane proteins，Inc蛋白)；②在包涵體腔或宿主細胞內分泌的可溶性效應蛋白，即非Inc蛋白[7]。它們在Ct發育以及與宿主細胞的相互作用中均發揮重要作用，如IncA、IncE和Cpos可調節宿主細胞囊泡運輸，IncD和IncV調節宿主細胞非囊泡運輸，IPAM、InaC、Tarp、CT694和CT166均可調節宿主細胞骨架，其中Tarp、CT694和CT166還可促進Ct的侵襲。以下將詳述沙眼衣原體 T3SS效應蛋白的功能。

2.1調節宿主細胞骨架和Ct侵襲 衣原體進入非吞噬上皮細胞伴隨宿主細胞質膜的改變。目前已證明Inc蛋白IPAM和InaC參與微管、微絲的破壞和高爾基體的重定位，非Inc蛋白Tarp、CT694和CT166通過調節宿主細胞肌動蛋白骨架促進Ct入侵。

Dumoux等[8]研究表明IPAM可募集并刺激中心體蛋白170(CEP170)重塑微管(MT)網絡。MT參與胞內運輸和維持細胞結構，是細胞骨架的重要組成部分，CEP170是維持包涵體形態、產生感染性子代所必需的蛋白。另有研究表明，在Ct感染的細胞中，F-肌動蛋白(F-actin)聚集在包涵體周圍，對維持高爾基體形態有重要作用[9]。通過干擾肌動蛋白聚合以及對比分析InaC突變株和野生株的性狀，發現InaC參與F-actin在包涵體周圍的積累。InaC還可募集ADP核糖基化因子1 (ARF1)和ARF4到包涵體膜并調節二者的激活，誘導MT翻譯后修飾，從而促進包涵體周圍高爾基體的重定位[10]。

易位的肌動蛋白募集磷蛋白(TarP)、CT694及CT166都可調節宿主細胞肌動蛋白進而促進Ct侵襲。TarP是衣原體早期的多域效應蛋白，介導肌動蛋白的成核和成束。Tarp可招募肌動蛋白，包含幾個與WH2結構域蛋白相似的C末端肌動蛋白結合域[11]；還包含一個富含脯氨酸的區域，可增強肌動蛋白的寡聚化。研究表明，酪氨酸磷酸化的Tarp結合并招募RAC1激活因子(Sos1和Vav2)，使TarP與Arp2/3復合物協同作用，提高肌動蛋白聚合速率并促進Ct侵襲[12]。Ghosh等[13]使用熒光報告等位基因交換誘變(FRAEM)技術，表明F-肌動蛋白(F-actin)結合域的C末端對Tarp介導的Ct入侵宿主細胞有重要作用。對TarP的研究通常集中在Ct蛋白的同源物。鼠衣原體(C.muridarum，Cmu)、豚鼠衣原體(C.caviae)和肺炎衣原體(C.pneumoniae，Cpn)中的TarP同源基因沒有磷酸結構域，但均可招募肌動蛋白，表明Tarp的磷酸化區域不是肌動蛋白募集的必要條件[14]。易位膜相關效應蛋白A(TmeA)即CT694，由T3SS分泌并存在于EBs中。CT694不直接與肌動蛋白相互作用，而是與人AHNAK蛋白的重復區和C末端相互作用，并影響宿主細胞肌動蛋白應激纖維的形成[15]。使用FRAEM技術構建CT694突變株[16]， 表明CT694的缺失可導致小鼠感染率降低以及對宿主細胞侵襲水平下降。無論是否敲除AHNAK蛋白，CT694突變株對宿主細胞的侵襲均減弱，然而野生型Ct對宿主細胞的侵襲沒有缺陷[17]，表明Ct有效入侵宿主細胞需要CT694，但與CT694和AHNAK的相互作用無關。TarP和CT694是目前與侵襲相關最具特征的效應蛋白，另有CT166也具有同樣的作用。CT166只存在于Ct生殖生物型，與艱難梭菌毒素的葡萄糖基轉移酶(GGTs)的N末端具有同源性[18]。使用高感染復數(MOI)的沙眼衣原體D型感染宿主細胞，可導致宿主細胞變圓和肌動蛋白重組，這可能下調RAC1介導的信號從而導致衣原體侵襲所需的宿主細胞肌動蛋白骨架變化[19]。

2.2影響宿主細胞免疫反應 衣原體感染宿主細胞會產生多種效應因子，使宿主產生免疫反應。目前已證明Inc蛋白Cap1(CT442)和CrpA(CT529)刺激機體產生適應性免疫反應，CT143刺激促炎因子分泌，非Inc蛋白TepP調節宿主細胞固有免疫信號。

易位早期磷酸化蛋白(TepP)即CT875，是Ct感染早期分泌最豐富的效應蛋白。Tarp、CT694和TepP均與T3SS伴侶蛋白-SycE樣伴侶1(Slc1)相互作用并促進分泌，被傳遞到宿主細胞質后定位在新生包涵體附近[20]。TepP一旦轉移到宿主細胞，便在多個酪氨酸和絲氨酸殘基處磷酸化。研究表明，TepP可通過四肽重復序列1(IFIT1)和IFIT2下調IFN誘導蛋白的表達[21]。Carpenter等[22]研究表明TepP對宮頸上皮細胞中衣原體的復制、I型IFN基因的激活以及I類磷酸肌醇3激酶(PI3K)和CrkL向新生包涵體的募集具有重要作用。雖然TepP是Src激酶酪氨酸磷酸化的靶點，但這些修飾似乎不影響PI3K或CrkL的募集。TepP的易位與細胞內磷酸肌醇(3,4,5)-三磷酸的增加有關，而與生存前激酶Akt的激活無關[22]，提示TepP介導的PI3K激活僅限于包涵體早期。總之，Ct可通過TepP限制PI3K來調節細胞信號通路和膜轉運，抑制INF的產生，從而在感染早期顛覆宿主細胞固有免疫，這可能是衣原體生長所必需。Inc蛋白Cap1和CrpA可引起機體產生保護性免疫，同時二者均可被MHC I類分子提呈給CD8+T細胞，刺激機體產生適應性免疫反應，從而促進感染小鼠體內Ct的清除[23]。CT143可通過激活THP-1細胞中的p38/MAPK信號通路刺激促炎因子分泌，這與Ct感染過程中的炎癥反應有關[24]。

2.3調節宿主細胞囊泡和非囊泡運輸 由于Ct缺乏所需的生物合成酶，因此需要與各種宿主途徑進行復雜的相互作用來獲取鞘磷脂、膽固醇和甘油磷脂等，包括囊泡運輸和非囊泡運輸途徑。囊泡運輸可通過宿主可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著受體(SNARE)蛋白的募集來調節，是細胞內融合機制的關鍵組成部分。至少有3個Inc蛋白(IncA、IPAM和InaC)含有SNARE基序，它們能夠像SNARE蛋白一樣發揮作用從而抑制囊泡融合。其中，IncA的SNAREs樣結構域(SLD-1)和SLD-2可抑制二者介導的內吞性膜融合，從而避免包涵體與有害囊泡融合[25]。此外，IncE可與逆轉運復合體中的SNX5和SNX6結合，調控宿主的逆向囊泡轉運，使Ct感染性子代增加[26]。Rab GTPases也是控制真核細胞囊泡運輸的主要因素。Faris等[27]證明CpoS靶向多個Rab GTPases及其同源效應蛋白至包涵體，并且攔截來自循環途徑的宿主囊泡，從而調節轉鐵蛋白和甘露糖-6-磷酸受體(CI-M6PR)的轉運。它們的活性對于Ct攝取營養、避免包涵體與溶酶體融合和穩定包涵體膜具有重要作用。

目前已知Inc蛋白IncD和IncV參與非囊泡運輸。Ct可通過包涵體與內質網形成的膜接觸位點(MCS)獲取脂質。神經酰胺內質網轉運蛋白(CERT)是MCS的功能性成分，參與神經酰胺從內質網到高爾基體的轉運。然后經鞘磷脂合酶2(SMS2)將神經酰胺轉化為鞘磷脂，鞘磷脂對Ct的生長至關重要[28]。研究表明，IncD可與CERT相互作用并將其招募至內質網-包涵體MCS處，從而調控宿主細胞非囊泡運輸[29]。CERT中的FFAT基序介導了其與VAMP相關蛋白A(VAPA)和VAPB的相互作用，間接導致VAPA/B的募集。VAPA/B在包涵體周圍的募集也與IncD相關。IncV同樣可與VAPA/B的相互作用[30]，這種相互作用依賴于IncV所含的FFAT基序。IncV是建立內質網-包涵體MCS的重要因素，但不是唯一因素，提示還有其他分子參與此過程。

2.4參與染色質的重塑 目前已發現非Inc蛋白NUE和CT460參與染色質的重塑。蛋白質核效應因子(NUE)是含有SET結構域的衣原體蛋白，此結構域主要存在于控制基因表達和染色質結構的真核細胞組蛋白甲基轉移酶中[31]。體外甲基化實驗證明NUE能夠使組蛋白H2B、H3和H4甲基化，可能參與染色質的重塑。CT460是最新發現的T3SS效應蛋白，含有一個可能參與染色質重塑的SWIB/MDM2結構域。研究發現，該蛋白與嗜線粒體華診體(Waddliachondrophila)蛋白Wcw_0377同源，并且具有相同的SWIB/MDM2結構域[32]。SWIB/MDM2結構域主要存在于真核生物，可到達宿主細胞核從而與宿主細胞蛋白相互作用[21]，表明含有該結構域的蛋白可能與宿主細胞的相互作用有關。Kebbi-Beghdadi等[32]證明CT460與NUE相似，定位在感染細胞的細胞核中并在染色質重塑中發揮作用。

2.5調控衣原體EBs的產生及釋放 衣原體可通過細胞裂解或擠壓的方式將EBs從宿主細胞釋放。溶解釋放導致宿主細胞死亡，涉及半胱氨酸蛋白酶及細胞質膜的破裂；相反，擠出過程使宿主細胞保持完整，宿主細胞膜收縮然后排出EBs。現已發現，Inc蛋白CT228、MrcA和非Inc蛋白CT622參與此過程。

CT622可調控EBs的產生。研究表明，CT622可被T3SS抑制劑N′-4-硝基苯并酰肼阻斷[33]。Cossé等[34]證明CT622基因表達的缺失可導致Ct生長缺陷，構建CT622突變株表明EBs減少，這與Ct侵襲宿主細胞和EB-RB轉化的缺陷有關。通過X射線晶體學測定了CT622 C末端的三維結構，揭示了其與香葉基轉移酶(GGTases)和合成酶具有結構相似性[35]。擠出過程需要肌動蛋白聚合及RhoA、神經性Wiskott-Aldrich綜合征蛋白(N-WASP)、肌球蛋白II和肌球蛋白磷酸酶途徑的組成部分，如肌球蛋白磷酸酶靶亞基1(MYPT1)。Lutter等[36]證明CT228與MYPT1相互作用并將其招募至包涵體周圍微區，調節EBs的擠壓釋放。MYPT1介導的肌球蛋白輕鏈II(MLC2)磷酸化有利于擠壓釋放，而MLC2的缺失或去磷酸化有利于溶解釋放。Nguyen等[37]確定了MrcA與Ca2+通道肌醇1,4,5-三磷酸3型受體(ITPR3)之間的相互作用，并證明Ca2+信號通路參與EBs釋放的調節。Ca2+的增加可以促進MLC2的磷酸化激活肌球蛋白II活性，從而促進EBs的擠壓釋放。最終，原始細胞的完整可防止炎癥物質釋放，保護EBs免受宿主細胞免疫，從而促進感染的持續。

2.6調控宿主細胞凋亡 Ct為維持其完整的發育周期，在Ct復制的早期階段通過抑制促凋亡途徑和激活促存活途徑抑制細胞凋亡，在復制的中后期則誘導細胞凋亡使其得以繁殖。沙眼衣原體 T3SS效應蛋白在此過程中發揮了重要作用。現已發現，沙眼衣原體 Inc蛋白中的CpoS、IncC 和 CT383抑制宿主細胞凋亡，非Inc蛋白CADD參與宿主凋亡機制從而促進細胞凋亡。

Sixt等[38]證明Cpos通過與GTPaes Rab4分子相互作用靶向干擾素基因刺激因子(STING)，抑制宿主細胞過早死亡以利于包涵體在宿主細胞內完成發育周期。包涵體的過早破裂可導致自噬體的識別、內在凋亡的激活以及衣原體發育周期的過早終止。Weber等[39]通過inc基因的插入誘變，證明CpoS、IncC和CT383在維持包涵體膜穩定性方面起著重要作用。它們的缺失導致包涵體不穩定，細菌及其細菌成分釋放到胞漿中從而導致宿主細胞死亡增加。衣原體蛋白相關死亡結構域(CADD)在Ct感染的晚期表達[40]，與腫瘤壞死因子(TNF)受體共同定位于包涵體附近。CADD與TNF受體家族TNFR1、Fas、DR4和DR5的死亡域相互作用，但不與相應的下游銜接因子相互作用。并且CADD能夠結合多種含有TNF受體的死亡結構域，在瞬時轉染到各種哺乳動物細胞系時以caspase依賴的方式誘導細胞凋亡[41]。它的凋亡誘導作用可被caspase抑制劑阻斷，提示其通過參與宿主凋亡機制促進細胞死亡；表明CADD可調節感染細胞的凋亡途徑，揭示了宿主與病原體相互作用的新機制。

3 總結與展望

T3SS作為衣原體與宿主細胞重要的連接媒介，是有力的抗毒力靶點。大約10%的衣原體基因組編碼T3SS效應蛋白[42]，從而使Ct有效侵襲宿主細胞、獲取營養和逃逸固有免疫反應。目前對T3SS效應蛋白的功能有了一定的了解，但迄今為止尚未闡明所有功能。例如，對于調控衣原體EBs釋放機制的了解甚少。由于Ct的生存和增殖依賴于效應蛋白的選擇性相互作用，因此對Ct更廣泛的了解將是設計或優化抗菌藥物的有力工具。幸運的是，最近分子遺傳學的發展使科學家更深入地分析Ct的感染生物學。通過研究Ct的發病機制和生命周期對Ct的預防和治療有重要的科學意義。

利益沖突：無