新型冠狀病毒在Vero-E6細(xì)胞中的增殖特征分析

張炎華，何文祥，朱 穎，陳 煒，吳冰珊，修文瓊，陳宏彬，俞婷婷，鄢育青，吳晶晶，袁 平，張小鴻，駱 婧，翁育偉，鄭奎城

新型冠狀病毒(2019-nCoV)屬于β屬冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，常為多型性，直徑60～140 nm。該病毒的傳播力可能要高于SARS冠狀病毒，不同研究團(tuán)隊(duì)計(jì)算得到的基本再生指數(shù)(R0)有不同，大致在2～4之間[1-2]。病毒通過其表面的刺突蛋白(Spike protein，S蛋白)與宿主細(xì)胞表面的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)結(jié)合[3]而發(fā)生吸附、穿入、脫殼、生物合成與組裝、成熟與釋放等一系列增殖過程。2019-nCoV的體外培養(yǎng)可在Vero-E6、Huh7及人呼吸道上皮細(xì)胞進(jìn)行。為更好地了解2019-nCoV體外增殖情況，本研究利用一步增殖實(shí)驗(yàn)分析病毒在Vero-E6細(xì)胞中的增殖特征，并對(duì)比了不同實(shí)驗(yàn)方法下半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)的差異，以期為后續(xù)的研究提供一定的基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1材料來源 2019-nCoV病毒株(hCoV-19/Fujian/13/2020)由福建省疾病預(yù)防控制中心分離獲得并經(jīng)全基因組測(cè)序(序列號(hào)：GISAID No. EPI-ISL-411066)[4]，毒株經(jīng)Vero-E6傳代2代，毒株于接種后第6 d收獲，-80℃保存。病毒分離及TCID50測(cè)定等均在BSL-3實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。

1.1.2試劑及儀器 Vero-E6細(xì)胞(ATCC○RCRL-1586TM)、細(xì)胞培養(yǎng)基Minimum Essential Medium(Gibco，Ref. No.41500-034)、胎牛血清(PANSera ES，Cat. No.2602-P130707)、核酸提取試劑盒QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN，Cat. No.52906)、熒光PCR反應(yīng)體系為AgPath-IDTMOne-step RT-PCR Kit(Life Technologies，Cat. No.AM1005)以及中國疾控中心推薦的引物和探針[5]；儀器設(shè)備包括二氧化碳培養(yǎng)箱(Innova○Rnco-170)、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Life，Countess Ⅱ FL)、倒置顯微鏡(Nikon ECLIPSE TS100)、熒光PCR儀(ABI QuantStudioTMDx)等。

1.2 方 法

1.2.1病毒半數(shù)感染劑量(TCID50)的測(cè)定 將接種后第6 d(細(xì)胞已完全病變)的病毒培養(yǎng)液凍融1次后，離心取上清并分裝凍存。取1管凍存的病毒液按半對(duì)數(shù)稀釋法自10-2稀釋至10-7，96孔板中長(zhǎng)滿單層的Vero-E6貼壁細(xì)胞用細(xì)胞維持液(含2%胎牛血清的MEM)洗滌2遍，加入100 μL稀釋好的病毒液，每個(gè)稀釋度重復(fù)4孔，以細(xì)胞維持液為陰性對(duì)照，置36 ℃、5% CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育90 min，期間每30 min晃動(dòng)細(xì)胞板1次。孵育完成后吸出病毒液，用細(xì)胞維持液洗滌細(xì)胞1遍后，每孔加入200 μL細(xì)胞維持液，置36 ℃、5% CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育，每日觀察細(xì)胞病變，于接種后第6 d終止實(shí)驗(yàn)，根據(jù)Reed-Muench方法計(jì)算TCID50。為比較不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)TCID50的影響，本研究還設(shè)置了病毒凍融、病毒在貼壁細(xì)胞中吸附后是否洗滌以及不同細(xì)胞濃度懸液條件下測(cè)定TCID50的差異。

1.2.2病毒增殖及滴度測(cè)定 將病毒儲(chǔ)存液稀釋至5 TCID50/100 μL，取病毒液7.8 mL(根據(jù)培養(yǎng)容器底面積和測(cè)定TCID50時(shí)100 μL/孔的量換算)接種至T25(底面積為25 cm2)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中(細(xì)胞貼壁密度在95%～100%，細(xì)胞數(shù)量約2.42×106/瓶，MOI約為1.74×10-4TCID50/cell)，置36 ℃、5% CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育90 min，期間每30 min晃動(dòng)細(xì)胞瓶1次，孵育完成后吸出病毒液，用細(xì)胞維持液洗滌細(xì)胞1遍，往細(xì)胞瓶中加入10 mL細(xì)胞維持液，置36 ℃、5% CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育，從孵育后開始，每24 h觀察細(xì)胞病變并同時(shí)吸取0.55 mL增殖產(chǎn)物，離心后上清凍存于-80 ℃?zhèn)溆茫恋? d時(shí)終止實(shí)驗(yàn)。將每日收集上清從原始濃度開始半對(duì)數(shù)稀釋至10-5，并接種至96孔細(xì)胞板，每個(gè)稀釋度3孔，每日觀察細(xì)胞病變，測(cè)定病毒TCID50。

1.2.3不同時(shí)點(diǎn)病毒核酸含量的測(cè)定 取50 μL每日吸取的培養(yǎng)上清稀釋至500 μL后取140 μL進(jìn)行核酸提取，核酸洗脫量為50 μL，每個(gè)樣本重復(fù)提取核酸3次后根據(jù)中國疾控中心推薦的檢測(cè)方案進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)該方案推薦的引物擴(kuò)增N基因片段，測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物DNA的吸光度并計(jì)算其濃度。將已知濃度的擴(kuò)增產(chǎn)物系列稀釋后作為核酸擴(kuò)增模板，根據(jù)上述檢測(cè)方案測(cè)出不同核酸濃度對(duì)應(yīng)的Ct值(Cycle Threshold)后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每日增殖的培養(yǎng)上清液核酸濃度。

2 結(jié) 果

2.12019-nCoV病毒株TCID50的測(cè)定結(jié)果 根據(jù)細(xì)胞病變結(jié)果，計(jì)算出該毒株的半數(shù)感染劑量為10-3.7TCID50/100 μL。對(duì)比不同實(shí)驗(yàn)條件下的TCID50可以發(fā)現(xiàn)：凍融會(huì)降低病毒的感染滴度，應(yīng)盡量避免；細(xì)胞懸液為3×104/mL時(shí)的TCID50值低于2×105/mL時(shí)的TCID50值，但差異不大；病毒在貼壁的Vero-E6細(xì)胞中吸附90 min后吸去病毒液并洗滌1次時(shí)的TCID50值低于不吸去不洗滌時(shí)的TCID50值，但差異不大。不同實(shí)驗(yàn)方法下的TCID50結(jié)果見表1。

表1 不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)2019-nCoV TCID50測(cè)定的影響Tab.1 Effect of different test conditions on TCID50 determination of 2019-nCoV

2.2新型冠狀病毒在Vero-E6細(xì)胞中的增殖情況 將濃度為1.74×10-4TCID50/cell的病毒接種至Vero-E6細(xì)胞后，第1 d無肉眼可見的細(xì)胞病變，第2 d約有25%的細(xì)胞發(fā)生病變，第3 d有超過50%的細(xì)胞發(fā)生病變，第4 d絕大部分的細(xì)胞已發(fā)生病變。測(cè)定每日增殖產(chǎn)物的病毒感染滴度，根據(jù)N基因定量結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算上清液核酸濃度。結(jié)果顯示，2019-nCoV在Vero-E6細(xì)胞中的前48 h迅速增殖，平均復(fù)制周期約為3.29 h，核酸濃度和感染滴度在48 h左右達(dá)到峰值，之后核酸濃度維持在較高水平但感染滴度開始逐漸下降。增殖上清液的病毒滴度和核酸濃度結(jié)果見圖1和表2。

圖1 2019-nCoV在Vero-E6細(xì)胞中增殖時(shí)其感染滴度和RNA濃度的時(shí)間分布曲線Fig.1 Time distribution curve of the viral titer and RNA concentration of 2019-nCoV in Vero-E6 cells

表2 2019-nCoV在Vero-E6細(xì)胞中增殖時(shí)其感染滴度和RNA濃度的時(shí)間分布Tab.2 Time distribution of the viral titer and nucleic acid concentration of 2019-nCoV in Vero-E6 cells

3 討 論

病毒本身缺乏增殖所需的酶系統(tǒng)，只能在易感的活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行增殖。病毒增殖過程中的吸附、穿入、脫殼、生物合成與組裝、成熟與釋放等各個(gè)階段都影響著病毒在宿主細(xì)胞中的增殖特征。本文從病毒活性和數(shù)量相對(duì)時(shí)間變化兩個(gè)方面對(duì)2019-nCoV在Vero-E6細(xì)胞中的增殖情況進(jìn)行分析，獲得了較為初步的增殖特征。

無論從病毒感染滴度還是核酸擴(kuò)增結(jié)果來看，在起始MOI為1.74×10-4TCID50/cell條件下，2019-nCoV在Vero-E6細(xì)胞中的增殖情況均表現(xiàn)為接種后前2 d迅速增殖，并在第2 d左右達(dá)到峰值，這與SARS-CoV的增殖特征相近[6-7]。病毒感染滴度在第2 d后開始迅速下降，可能是由于細(xì)胞病變后，病毒失去寄生的宿主而無法繼續(xù)復(fù)制，加上培養(yǎng)條件下病毒逐漸失去活性所致。培養(yǎng)上清中的核酸經(jīng)過快速復(fù)制后維持在較高水平，反映了病毒的數(shù)量在培養(yǎng)上清中維持穩(wěn)定，但病毒感染活性逐步下降。從核酸水平來看，核酸濃度在0～24 h(第1 d)內(nèi)大約上升了126倍，在24～48 h(第2 d)內(nèi)大約上升了157倍，在48～72 h內(nèi)大約上升了1.7倍。由于第0 d培養(yǎng)上清中的核酸濃度僅表示吸附階段未被細(xì)胞吸附且未洗滌干凈的部分，已經(jīng)被細(xì)胞吸附的活病毒核酸難以估計(jì)，也就是說起始核酸濃度難以準(zhǔn)確估計(jì)，我們以24～48 h內(nèi)的核酸濃度變化來估算病毒的增殖速度。按照2n的增殖模型，我們可以計(jì)算出2019-nCoV病毒在Vero-E6細(xì)胞中的平均復(fù)制周期約為3.29 h，這比SARS-CoV在Vero-E6細(xì)胞中增殖的周期7～10 h[6，8]要短得多。

關(guān)于TCID50的測(cè)量方法，不同的病毒在不同的文獻(xiàn)中有差別，如腸道病毒使用2×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液來測(cè)量[9]，而流感病毒使用貼壁細(xì)胞來測(cè)量[10-11]。本文對(duì)不同細(xì)胞懸液濃度、病毒吸附貼壁細(xì)胞后是否洗滌以及病毒的凍融次數(shù)等條件對(duì)TCID50的影響做了初步比較，以供更多的研究者參考。本次研究表明，不同細(xì)胞懸液濃度、病毒吸附貼壁細(xì)胞后是否洗滌對(duì)測(cè)定TCID50影響不大，但用于TCID50測(cè)定的病毒液應(yīng)避免反復(fù)凍融，以免影響病毒感染滴度。

本文初步分析了2019-nCoV在Vero-E6細(xì)胞中的增殖情況，研究結(jié)果仍可為病毒的分離培養(yǎng)、抗病毒藥物研究以及疫苗研制等工作提供一定的參考意義。

利益沖突：無