慢性乙肝抗病毒治療過程中低病毒血癥對病毒學與肝臟獲益的影響

鄒銘南，蔡大川,2，任紅,2

(1.重慶醫科大學附屬第二醫院感染病科；2.重慶醫科大學病毒性肝炎研究所·感染性疾病分子生物學教育部重點實驗室，重慶 400010)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染呈世界性流行，據WHO報道全球約有2.57億慢性HBV感染患者，每年約有88.7萬人死于HBV感染，其中肝硬化和原發性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者中由HBV所致者分別為30% 和45%[1]。據估計，目前我國一般人群HBsAg流行率為5%～6%，慢性HBV感染者約7 000萬例，其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者約2 000～3 000萬例[2]。未經治療的CHB肝硬化年發生率為2%～10%，而在我國肝硬化患者中，由乙型肝炎病毒所致者占77%。代償期肝硬化患者進展為失代償期的年發生率為3%～5%，失代償期肝硬化患者5年生存率僅14%～35%。非肝硬化HBV感染者的肝細胞癌年發生率為0.5%～1.0%，肝硬化患者肝細胞癌年發生率則為3%～6%[1]。

在CHB的治療中，病毒的抑制情況與疾病的進展密切相關，病毒載量越低，進展為肝硬化HCC的風險也越低。來自中國臺灣的REVEAL研究報道[3]，作為HBV感染自然史的標志性研究，發現HBV DNA水平與肝硬化和HCC發生有關。此后亦有多項研究證明了此觀點[4-6]。因此，為了降低HBV感染相關病死率，抗病毒是基本的治療措施，對減少肝功能失代償、肝硬化和肝癌的發生率十分重要。

為了減少乙肝相關并發癥，降低肝硬化、肝硬化失代償和肝癌的發生率，降低與此相關的病死率、改善患者生活質量，各大指南對于符合治療標準的慢乙肝人群有明確的推薦意見，目前將丙酚替諾福韋(tenofovir alafenamide，TAF)、替諾福韋酯(tenofovir disoproxil fumarate，TDF)、恩替卡韋(entecavir，ETV)作為抗乙肝病毒治療的一線藥物。新版中國慢乙肝防治指南也提出CHB的治療目標是最大限度地長期抑制HBV復制，延緩和減少肝功能衰竭、肝硬化失代償、肝細胞癌和其他并發癥的發生。對此，國內專家共識[7]推薦長期抗乙肝病毒治療后HBV DNA<20 IU/mL，國外指南[8-9]則要求HBV DNA<10 IU/mL。

然而研究[10-13]表明，即使是使用恩替卡韋、替諾福韋這樣的一線藥物抗乙肝病毒治療，仍有20%～37.9%的患者在長期隨訪過程中仍未獲得完全病毒學應答(complete virologic response，CVR)或不能維持持續病毒學應答(maintain virologic response，MVR)，其HBV DNA水平低于2 000 IU/mL，但間歇或持續高于最低檢測下限，即為低病毒血癥狀態(low-level viremia，LLV)。低病毒血癥一詞最初來源于艾滋病抗病毒治療領域，然而目前在乙肝領域也發現低病毒血癥的存在，且與較差的臨床結局相關[12-14]。目前認為低病毒血癥狀態有兩種類型，其一為HBV感染后處于免疫控制期，即e抗原(HBeAg)陰性的非活動性HBsAg攜帶狀態，另一種則為慢性HBV感染患者經核苷(酸)類似物[(nucleos(t)ide analogues，NAs]治療后仍未取得完全性病毒學應答的狀態。本文所討論的即為后一種。

1 低病毒血癥發生的影響因素

藥物用量、服藥方式、患者的依從性等現實因素是導致LLV的重要原因[15-17],但研究表明仍有部分患者在規范使用ETV、TAF、TDF這類一線抗乙肝病毒藥物治療1年以上后仍處于低病毒血癥狀態[10-13]。其原因可能如下：(1)耐藥：一項回顧性隊列研究[13]納入258例接受ETV單藥治療的慢乙肝患者，回顧性對比耐藥患者與非耐藥患者在ETV治療24周時的特征，耐藥組中部分應答(PVR)的患者比例顯著高于非耐藥組，提示抗病毒治療后HBV DNA 水平和治療24周時的病毒學應答可能與耐藥緊密關聯。(2)與肝細胞內HBV RNA、肝纖維化病理分期相關：Wang等[18]納入接受恩替卡韋治療大于1年且血清HBV DNA未檢出的慢乙肝患者的研究結果表明，慢乙肝患者HBV抑制不充分，其血清和肝細胞內HBV RNA與肝纖維化病理分期顯著相關。(3)與cccDNA相關：共價閉合環狀DNA(cccDNA)半衰期長，難以從體內徹底清除，這可能是導致檢出低水平的HBV DNA的原因之一[19]。(4)基線高HBV DNA水平：Yuen等[20]的對恩替卡韋初治的222例患者進行了為期三年的研究發現，所有基線時HBV DNA水平<108拷貝/mL的患者在恩替卡韋三年的治療后均可達到HBV DNA低于檢出下限，而在基線時HBV DNA>108拷貝/mL的34例患者中，有8例治療三年后仍可檢測到HBV DNA病毒，8例中有6例為乙肝低病毒血癥狀態。(5)治療方案的影響：在艾滋病領域，有研究認為LLV的發生還與高效抗逆轉錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy，HARRT)的方案選擇相關[21]。但在乙肝領域，以往使用阿德福韋酯、拉米夫定等抗病毒藥物治療，其有效性低于目前的恩替卡韋、替諾福韋，完全病毒應答率相對較低，但目前各大指南已將恩替卡韋和替諾福韋作為乙肝抗病毒治療的一線用藥，臨床亦可見大部分患者使用恩替卡韋和替諾福韋抗病毒治療，但目前似乎較少研究對于兩種藥物使用后的低病毒血癥發生率進行比較。既往EASL指南提到ETV治療48周或52周，HBeAg陽性或陰性患者的HBV DNA檢出率為33%和10%(HBV DNA<60～80 IU/mL)，TDF治療48周或52周，HBeAg陽性或陰性患者的HBV DNA檢出率為24%和7%[22]。TAF治療48周HBeAg陽性或陰性患者的HBV DNA檢出率為36%和7%(HBV DNA>29 IU/mL)[23-24]。具體對不同一線藥物之間出現LLV的情況還需要進一步研究實踐。

2 LLV與臨床結局

2.1 與乙肝抗病毒治療患者的耐藥發生相關

2017年發表在Clinical and Molecular Hepatology上的一項研究[25]分析比較了恩替卡韋治療后耐藥患者與非耐藥患者的臨床特征差異，發現ETV耐藥與治療24周時未達到完全病毒學應答顯著相關。該研究納入258例接受恩替卡韋單藥治療的慢乙肝患者，其中56例為NAs經治患者，202例為恩替卡韋初治患者，結果8例患者出現基因耐藥，但分析顯示恩替卡韋經治與否與耐藥的出現并無統計學意義。多因素分析顯示基線治療后6個月HBV DNA載量和CVR缺失是發生耐藥的顯著獨立影響因素。提示不完全病毒學應答與發生乙肝抗病毒耐藥相關。香港的一項回顧性隊列研究[26]，納入440例隨訪(34±9)月的慢乙肝患者(其中HBeAg陰性者160例)，這些患者均使用恩替卡韋0.5 mg/d抗乙肝病毒治療并且治療療程至少24個月，至少每6個月復查1次HBV DNA，該研究中HBV DNA檢測下限為20 IU/mL，結果發現在第1、2、3年的累積維持病毒抑制率分別為76.5%、83.0%、88.3%。第12月時HBV DNA不可測者324例，可測者116例。12月時HBV DNA不可測組的3年累積維持病毒抑制率為99.1%(95%CI：98.6～99.6)，與之相比未獲得完全病毒學應答者，繼續維持原方案治療，其3年累積病毒學抑制率僅為57.5%(95%CI：52.7～62.3，P<0.001)。并且在該研究中，還發現12月時未完全獲得病毒學應答的患者隨著時間延長(1、2、3年分別為1.7%、2.6%、2.6%)，其累積耐藥發生率高于獲得完全病毒學應答的患者(1～3年均為0%，P=0.004)。

2.2 與肝纖維化進展相關

研究[27]發現，即使經過有效的乙肝抗病毒治療，仍有11%的患者出現肝纖維化進展。北京友誼醫院的一項研究[12]，探討了接受ETV治療的CHB患者肝纖維化進展的危險因素，共納入具有基線和治療后78周肝組織活檢結果的患者239例，所有患者均為初治的慢性HBV感染患者，其中位基線HBV DNA水平為6.5logmL，研究HBV DNA檢測下限為20 IU/mL，均予以恩替卡韋治療。單因素和多因素分析顯示，78周時HBV DNA的檢出率與肝纖維化的進展相關(OR=4.84，95%CI：1.3～17.98，P=0.019)。78周時血清中HBV DNA的檢出率在肝纖維化進展的患者中較高(50%)，而肝纖維化減輕患者為19%，肝纖維程度不清組為26%(P=0.015)。同時發現與肝纖維化逆轉患者相比，肝纖維化進展的患者病毒應答率更低，且多數患者病毒載量維持在20～200 IU/mL，因此他們推測低病毒血癥仍然可能促進肝纖維化進展。土耳其的研究員開展了一項回顧性研究[28]，在年輕的未抗病毒治療的慢乙肝LLV患者中，依然有近三分之一存在明顯的肝纖維化。肝活檢提示139例LLV(HBV DNA<2 000 IU/mL)中42例出現明顯的肝纖維化，達到30.2%。這也說明低病毒血癥亦可出現肝纖維化程度進展。

2.3 與肝癌發生相關

韓國Sinn等[29]納入了符合研究標準的385例無抗病毒治療史的基線低病毒載量(HBV DNA 12～1 999 IU/mL)HBV感染代償期肝硬化患者，將完全病毒學應答定義為血清HBV DNA水平不可測(<12 IU/mL)，中位隨訪5.6年，基線低病毒血癥的代償期肝硬化患者其5年肝癌累積發病率為2.2%。在未行抗病毒治療的患者中，HBV DNA升高組、HBV DNA維持可測但處于低水平組(12～1 999 IU/mL)、HBV DNA維持不可測組(<12 IU/mL)的HCC的5年累積發病率分別為13.3%、8.8%、1.4%。所有隨訪患者中，共37例患者發展為HCC，其中4人基線時HBV DNA不可測，33人為低病毒載量者，在后續的隨訪過程中，其中2人仍保持HBV DNA不可測，22人為低病毒載量狀態，13人出現過HBV DNA載量升高。即使是隨訪期內仍維持低病毒血癥的患者其5年累積肝癌發病率也可達到8.8%。與之相比，低于檢測下限組的患者其HCC發生率明顯降低。因此作者認為代償期肝硬化患者只要病毒可測，即使病毒水平低，其發生HCC的風險也并不低，都應該考慮抗病毒治療。另一項韓國回顧性研究[13]則納入875例符合納入標準的基線HBV DNA≥2 000 IU/mL的接受恩替卡韋單藥初治抗病毒治療患者，中位隨訪4.5年(1.0～8.7年)，85例(9.7%)發展為HCC，他們將維持病毒學應答(MVR)定義為持續HBV DNA不可測(<12 IU/mL)，在這項研究中MVR率較低，僅為57%。結果顯示比起MVR患者，HCC更常見于有過LLV的患者，LLV患者發生HCC的風險是MVR患者的1.98倍。這一數據在肝硬化患者中更為顯著，肝硬化LLV患者發生肝癌的風險明顯高于MVR(5年HCC累積發病率：23.4%vs.10.3%，HR=2.20，95% CI：1.34～3.60，P=0.002)。多因素分析顯示，LLV是發生HCC的獨立危險因素。因此，ETV治療期間出現LLV與更高的HCC風險有關，尤其是肝硬化的LLV患者HCC風險增加更為明顯，提示一線抗病毒治療過程中的LLV不可忽視。

病毒學應答的速度亦與HCC的發生存在關聯。Nam等[30]的研究中納入325例HBeAg陽性的高HBV DNA病毒載量的NAs初治慢乙肝患者，予以恩替卡韋或替諾福韋治療，隨訪4年，該研究中HBV DNA檢測下限為12 IU/mL，將完全MVR定義為經治療HBV DNA病毒載量低于12 IU/mL。隨訪1年時僅124例獲得CVR，而201例未獲得CVR。而即便是使用一線抗病毒藥物恩替卡韋和替諾福韋治療，至隨訪4年時仍有68例未獲得CVR。研究中共出現17例HCC，56例進展為肝硬化。結果發現治療1年(HR=4.54，95%CI：1.03～19.93，P=0.045)或2年(HR=3.38；95%CI：1.24～9.23；P=0.018)內未獲得CVR的患者比1年內(HR=1.95，95%CI：1.04～3.66，P=0.037)或2年內(HR=2.44，95%CI：1.41～4.22，P=0.037)獲得CVR的患者具有更高的累積肝癌發病率。而在2年內經抗病毒治療獲得乙肝病毒CVR是與降低HCC發生風險和減輕肝硬化進展相關的。但當達到CVR時間大于2年時，無論是否獲得CVR，其HCC累積發病率無明顯差異。有意思的是當該研究將HBV DNA檢測下限設定為80 IU/mL和2 000 IU/mL時并未發現這一病毒抑制速度與HCC發生率的相關性，這也提示更低更精確的HBV DNA檢測技術對于慢乙肝的治療、監測、預后相當關鍵，而為了減少慢乙肝進展為HCC、肝硬化，不僅需要獲得CVR，更要快速獲得CVR。對于那種NAs治療2年仍未獲得CVR的患者，或許應當考慮更換治療方案。

2.4 降低肝癌生存率相關

Kim等[31]進行了一項研究HBV DNA水平與肝癌生存率的研究，該研究納入565例HBV相關的診斷肝癌時存在低病毒血癥的肝癌患者，其HBV DNA水平波動在51～579 IU/mL，其中143例基線時即已使用乙肝抗病毒藥物，使用的乙肝抗病毒藥物以恩替卡韋為主，此外還有阿德福韋酯、拉米夫定、替比夫定、替諾福韋等，結果33%維持CVR，39%出現LLV，28%經歷病毒反跳，將這幾組患者進行對比，三組間基線HBV DNA水平分別為84(26～326)IU/mL、124(50～384)IU/mL、546(134～999)IU/mL。平均隨訪(4.1±2.1)年的隨訪期限內，175例患者(31%)去世，整個研究隊列的5年存活率為68.1%。MVR組、LLV組、病毒反跳組的5年存活率分別為74.3%、67.3%和61.7%，差異具有統計學意義(P=0.015)。表明病毒反跳與更差的預后相關，病毒反跳組與MVR組相比預后更差(HR=1.71，95%CI：1.15～2.55，P=0.007)；與MVR組相比，持續LLV的患者生存率更差(HR=1.39，95%CI：0.95～2.04，P=0.083)。提示在HCC合并LLV的患者要早期抗病毒治療，抑制病毒復制，減少LLV和病毒反跳的出現，增加HCC患者的生存率。

3 治療

2017 EASL[32]、2016年APASL[33]和2018年AASLD[9]均推薦失代償和代償期肝硬化患者，不管其HBV DNA和ALT水平如何都進行抗病毒治療。2019年中國新版的慢乙肝防治指南則推薦對于血清 HBV DNA 陽性的代償期乙型肝炎肝硬化患者和 HBs Ag 陽性失代償期乙型肝炎肝硬化患者，建議抗病毒治療。對于低病毒血癥患者，尤其是已經使用非一線甚至是一線抗病毒藥物如恩替卡韋治療但仍不能獲得或者維持完全MVR的患者，他們是否應繼續原方案治療，還是更換不同的治療方案，目前各大指南對此無明確推薦。2018年AASLD建議不管ALT水平如何，使用恩替卡韋或替諾福韋單藥治療的持續低病毒血癥的患者繼續單藥治療，但證據等級較低，未提示是否應該更換治療方案，2016年韓國指南[34]則推薦對于正在使用高屏障藥物抗病毒治療的患者，可選擇換用另一種高屏障藥物或繼續原方案治療，但證據等級仍較低。2015年更新版的中國慢性乙肝防治指南[35]中將乙肝抗病毒應答不佳定義為NAs抗病毒治療中依從性良好的患者，治療 24周時HBV DNA較基線下降幅度>2log10 IU/mL，但仍然可以檢測到。2019年新版中國慢性乙肝防治指南中推薦應答不佳的患者，即采用恩替卡韋、TDF 或 TAF 治療 48周，若 HBV DNA>2×103IU/mL，排除依從性和檢測誤差后，可調整 NAs 治療方案(采用恩替卡韋者換用 TDF 或TAF，采用TDF或TAF者換用恩替卡韋，或兩種藥物聯合使用)。然而，上述中國指南中僅提及對于抗病毒治療應答不佳的患者的治療策略，指南中無明確的HBV DNA檢測下限規定，對于那些HBV DNA<2×103IU/mL但仍可被檢測到的患者尚無更多推薦，中國乙肝抗病毒指南尚未提及低病毒血癥的定義。2016年APASL、2017年EASL亦未提及針對這類患者該如何處理。因此對已經規范使用NAs抗病毒治療但仍處于低病毒血癥狀態的患者其治療策略仍屬盲區，尚缺乏統一的標準。

目前學界對于低病毒血癥患者治療方案的討論層出不窮。中華醫學會肝病學分會肝炎學組專家推薦[7]，使用敏感的檢測方法檢測治療后的HBV DNA 水平，如果是應用一線藥物應答不佳患者，可調整NAs治療方案，換用其他一線藥物或兩種一線藥物聯合使用。

實際上基線時的HBV DNA水平與患者使用NAs抗病毒治療后達到CVR的時間相關，延長其治療時間，部分患者最終可以獲得CVR[20]。但對于部分LLV患者延長原治療方案，亦可能仍不能獲得CVR，另外，HBV DNA的持續存在有可能導致肝病進展、肝臟相關并發癥發生風險增加。我國香港一項回顧性研究[26]納入446例ETV治療的慢乙肝患者，治療12個月應答不佳者繼續原方案治療，其3年累積病毒學抑制率僅57.5%。韓國團隊進行了一項開放標簽多中心的隨機對照研究[36]，納入符合研究標準的45例ETV初治治療療程超過12個月但HBV DNA大于60 IU/mL除外ETV耐藥的部分病毒學應答的慢乙肝患者，隨機分為TDF治療組(22例)和維持ETV治療組(23例)，結果TDF治療組的病毒抑制率明顯高于維持ETV治療組，其HBV DNA水平明顯較維持ETV治療組更低，提示對于ETV治療后PVR患者更換治療方案比維持原方案更佳。

日本九州大學一項多中心、回顧性研究[10]發現NAs治療48周但HBV DNA水平在20～2 000 IU/mL的患者定義為部分病毒學應答(partial virologic response，PVR)，納入313例NAs治療大于2年慢乙肝患者更換其抗病毒治療方案為TAF，313例患者中ETV組191例，ETV治療的患者中有38例(19.9%)為PVR，122例為NA聯用組(包括LAM/ADV,LAM/TDF,ETV/ADF,ETV/TDF)，在聯合組中9例(7.4%)為PVR。轉換為TAF治療48周后，幾乎所有患者都獲得CVR(HBV DNA<20 IU/mL)，ETV經治組97.1%(33/34)，NAs聯合組77.8%(7/9)，尤其在ETV組，第48周的HBV DNA抑制率顯著增加，從75.9%增加到96.9%(P<0.001)。

對于使用恩替卡韋后僅獲得PVR的患者，既往研究[37-39]顯示在PVR的慢性乙肝患者中，TDF單藥治療與ETV+TDF聯合治療在獲得CVR方面作用相當，而使用聯合治療可能導致患者的治療成本增加、依從性下降。但目前四川大學華西醫院團隊進行了一項回顧性研究[40]對此則有不同的看法，他們對ETV治療后獲得PVR的慢性乙肝患者更換為TDF單藥治療和TDF+ETV聯合治療的效果和安全性進行比較。研究納入143例經ETV治療僅獲得PVR的HBeAg陽性的慢性乙肝患者，更換其治療方案為TDF單藥治療，或TDF+ETV聯合治療，其中TDF單藥治療組63例，TDF+ETV聯合治療組80例，治療48周時，TDF+ETV聯合治療組病毒學應答率高于TDF單藥治療組(88.8%vs.71.4%；P=0.009)。然而目前對于NAs經治，尤其是一線NAs經治療后仍呈低病毒血癥的治療管理尚無統一標準，目前尚需要更多研究來探索更換、聯合或維持原治療方案，哪種方式對治療LLV患者更佳。

4 討論與總結

結合目前已發表的文獻[9,13]，可將LLV定義為HBV DNA 持續或間歇大于檢測下限但小于2 000 IU/mL，研究發現LLV與抗病毒藥物耐藥、肝纖維化進展、肝癌發生風險增加、肝癌存活率下降相關，對于LLV患者可考慮繼續用藥、換藥或者加用抗病毒藥物的方法進一步降低病毒水平，但選擇哪種方案更優目前尚無定論。如今隨著臨床檢測方法進步，對HBV DNA的檢測已可使用更高靈敏度的方法，普通檢測方式其檢測下限可達100～200 IU/mL，高精度檢測其檢測下限已可達10 IU/mL以下，現中國國內常用的高靈敏度檢測下限多為20 IU/mL，對于已經接受NAs治療且治療時間大于24周的慢性乙肝患者，使用該種高靈敏度方法檢測其HBV DNA大于檢測下限，可以認為應答不佳或部分病毒學應答[16]。因此當HBV DNA檢測技術不斷提升、HBV DNA檢測下限下降，僅談論低病毒血癥或許不足以描述低水平HBV DNA對HBV 感染患者肝臟病理生理的長期影響。依據指南對乙肝治療最大限度抑制病毒的目標，臨床探討乙肝治療應將目標投向更低限度的HBV DNA水平。Sun等[12]研究亦發現這些處于低病毒血癥狀態的患者其HBV DNA水平多為20～200 IU/mL，遠低于低病毒血癥定義的2 000 IU/mL。因此對比低病毒血癥，這些患者更適合描述為極低病毒血癥(very low-level viremia,VLLV)患者。但目前尚無更多研究探討極低病毒血癥患者在肝纖維化進展、肝功能失代償、肝癌發生率、總生存率等方面的影響。低病毒血癥對慢乙肝患者的病理生理影響是否可以涵蓋極低病毒血癥帶來的影響？不同的低水平HBV DNA檢測下限之間有無臨床意義？我們是否應該無盡地追求更低的HBV DNA檢測水平？通過一線藥物治療發生的低病毒血癥與自然狀態下取得的低病毒血癥在病毒學、免疫學和臨床結局間有無差別？除了現有的NAs間的相互轉換，干擾素在減少低病毒血癥方面有無價值？總之，目前尚需要更多研究來探索NAs經治未獲得完全病毒應答而存在VLLV的CHB患者其不同HBV DNA水平對于HBV慢性感染患者的肝臟及生存率遠期影響，為臨床醫生治療及治療后監測乙肝患者提供科學依據。