口咽鱗狀細胞癌中人乳頭狀瘤病毒精準檢測研究進展

李志鵬 范志偉 王文龍 卜祥斌 張凌楠 馬向瑞

(濱州醫學院，山東 濱州 256603 1 附屬醫院口腔頜面外科； 2 口腔醫學院； 3 附屬醫院口腔內科； 4 附屬醫院口腔正畸科)

口咽部位于軟腭和會厭上緣平面之間，借咽峽通向口腔，主要解剖結構包括軟腭、舌根(界溝后1/3)、咽側壁、咽后壁以及扁桃體等[1]。2017年第8版美國癌癥聯合委員會(AJCC)[2]中TNM分期將口咽鱗狀細胞癌(OPSCC)按照有無人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染分為HPV相關性鱗狀細胞癌(OPSCC-HPV)和非OPSCC-HPV。近年來OPSCC發病率呈現上升趨勢，主要歸因于高危型HPV的感染，尤其是HPV16[3]。2018年，美國病理學家協會(CAP)建議把HPV檢測作為診斷OPSCC的一項輔助檢查[4]。由于人種差異以及文化背景和生活方式不同，各個國家OPSCC患者HPV的感染率不同，我國OPSCC患者HPV的感染率低于20%,而北美地區約為56%，歐洲地區為17%～39%[5]。不同地區人群HPV感染率不同，推薦的檢測方法也不相同。如果完全按照國外相關指南或者共識標準化我國檢測方案，將會使我國OPSCC-HPV的檢出率出現較大差異。因此本文就HPV的分子特性及其獨特生物分子標志物檢測現狀做一總結，以求進一步探索OPSCC-HPV更加特異和靈敏的檢測方法。以供實驗室或臨床借鑒。

1 HPV

HPV在頭頸部的研究始于1901年，當時描述了疣狀病變通過口交進入口腔并進行傳播[6]。隨后大量的研究結果證明HPV與頭頸部鱗狀細胞癌(HNSCC)，尤其是與OPSCC的發生密切相關。國際癌癥研究機構(IARC)分別在2007年和2012年正式調查并分析了HPV對人類的相關影響，并得到了足夠的證據表明口咽部確實存在HPV16感染后的致癌性[7]。

HPV是一種無包膜雙鏈DNA病毒，大約有8 000個堿基對，包括200多種亞型，廣泛感染人類上皮細胞并引起尋常疣、尖銳濕疣、宮頸癌、肛門癌和口咽癌等疾病[8]。根據與宮頸癌的關系，HPV類型被分為高風險(HPV 16、18、31、33和35型等)和低風險(HPV 26、30、34以及53型等)兩種類型[9]。高風險HPV(尤其是16、18型)可極大地促進相關腫瘤的發生，特別是宮頸鱗狀細胞癌以及一些其他的生殖器惡性腫瘤等[9]。HPV可以分為3個部分：①早期區包含7個開放閱讀框(E1～E7)，于病毒感染早期表達，并在病毒的復制、免疫逃逸和細胞轉化中發揮重要作用；②晚期區(L)編碼衣殼蛋白L1和L2，該類蛋白參與病毒的包裝和釋放；③長控制區(LCR)作為調控元件參與病毒轉錄和復制[10]。當人體感染HPV后，E6與腫瘤抑制蛋白P53結合，并通過蛋白酶介導途徑抑制P53的表達，進而抑制其促凋亡功能；E7與成視網膜細胞瘤蛋白(PRb)結合，下調PRb進而促進P16的表達，使相關的細胞周期調節因子無法控制細胞分裂，從而使細胞增殖失控，最終導致腫瘤的發生[11-12]。當然，HPV的致癌機制遠非經典途徑如此簡單。GILLISON等[12]最近研究發現，HPV促癌蛋白會引起宿主基因(凋亡基因、細胞增殖基因和免疫基因等)的不穩定性，形成區別于非OPSCC-HPV的獨特基因組，從而促進腫瘤的發生。

2 HPV生物標志物

目前HPV生物標志物主要包括在組織中直接檢測病毒的DNA、P16和E6/E7 mRNA，在血清、血漿及唾液中檢測抗體、病毒的DNA和E6/E7 mRNA。大多數學者認為應用RT-PCR檢測新鮮腫瘤組織中HPVE6/E7 mRNA是診斷轉錄活躍的高危HPV的“金標準”，其他檢測方法靈敏度和特異度的判斷也大多與該方法進行比較。但由于新鮮腫瘤組織的獲取不適用于所有人群，且RT-PCR技術檢測病毒RNA本身也存在一定的局限性，在國內外臨床中的應用尚沒有普及。因此臨床上應對不同檢測目的和樣本來源選擇適合的HPV生物標志物進行研究，以提高病毒的檢出率。

2.1 腫瘤組織中DNA水平

對HPV DNA的檢測可以直接反應腫瘤組織中是否存在病毒。針對L1序列設計的引物(例如GP5/GP6 引物對)能夠擴增多種HPV類型，常被用于檢測多種HPV亞型。最新的一項Meta分析結果顯示，PCR技術檢測腫瘤組織中HPV DNA的靈敏度和特異度分別為98%和84%[13]。但還有一種情況是，病毒整合到宿主基因組后，L1區域可能被刪除，從而降低了HPV檢測的靈敏度。另外在石蠟包埋組織(FFPE)中，PCR技術也可能無法檢測到HPV，因為樣本中的基因組序列很可能在甲醛固定、儲存過程中被破壞了。同時由于PCR技術本身檢測的特點，結果的靈敏度較高，也可能會檢測到具有可疑致癌意義的極低拷貝數的病毒，從而增加了假陽性的風險。

DNA原位雜交(ISH)技術是一種利用標記DNA探針與HPV DNA序列互補技術對所有已知類型HPV進行檢測的方法。高達10%的OPSCC-HPV是由HPV16以外的亞型引起的，因此雞尾酒探針對于多種高風險亞型的檢測有重要意義。該方法在高倍顯微鏡下不僅能夠直接觀測到是否有HPV DNA，還有助于確定HPV DNA在組織和細胞中的位置，進而顯示病毒的狀態(擴散信號表明存在游離型HPV，點狀信號表明存在整合型HPV)，從而提高了檢測的特異度。然而，由于缺乏清晰的染色信號，檢測人員主觀判斷所導致結果的差異可能高達10%。總的來說，應用PCR或ISH技術檢測組織或者細胞中的HPV DNA都不能確定HPV是否具有活性[5]。

2.2 腫瘤組織中RNA水平

相對于HPV DNA，HPVE6/E7 mRNA的檢測結果更加準確，RT-PCR針對不同HPV的E6/E7設計合適的引物，進而分析病毒的亞型和評估病毒的毒性。然而，該技術操作難度較大，對結果的解釋也可能存在主觀判斷，故不適用于常規的病理實驗室[13]。類似于DNA ISH，E6/E7 mRNA ISH也是采用雞尾酒探針的方法，從各種HPV亞型中對E6/E7 mRNA進行檢測。目前常用的RNA-scope方法可以直接顯示常規處理組織中的病毒mRNA，并且能識別HPV在細胞中的位置，從而提高了檢測的特異度[14]。UKPO等[14]通過免疫組織化學(IHC)方法檢測腫瘤組織中的P16，結果與E6/E7 mRNA ISH的一致性達到了96.4%，與DNA ISH的一致性僅為79.3%，這也進一步說明E6/E7 mRNA ISH的靈敏度是優于DNA ISH的。

無論哪種方法檢測RNA都要考慮到：①FFPE樣本中RNA可能受到污染或破壞。②生物體液樣本中含量較低的RNA可能會影響檢測結果。

2.3 腫瘤組織中蛋白水平

P16是一種腫瘤抑制蛋白，通過抑制CDK4和CDK6的磷酸化來調節細胞周期，從而阻止PRb的磷酸化。在HPV的生命周期中，E7可使PRb失活，從而導致P16等細胞周期相關蛋白的上調且達到IHC容易檢測的水平，因此P16的上調可以作為活躍的HPV感染的標志。由于低成本、易獲取、高靈敏度以及較高的觀察一致性，國外很多學者傾向于把P16作為OPSCC中HPV感染的替代標志物。ABDELHAKAM等[15]針對104例OPSCC患者進行回顧性研究，發現腫瘤組織中P16陽性率達到了89.4%。然而也有一些研究指出，P16的高表達并不能反映HPV的轉錄活性，因為其升高還受到其他非致癌機制的調控，如與HPV無關的神經干細胞以及良性鱗狀細胞也可以過度表達P16。TRIBIUS等[16]研究顯示采用IHC方法檢測腫瘤組織中P16大約有5%假陽性風險。P16作為HPV感染的替代指標是否可靠在國內外一直備受關注，但因我國HPV感染率較低，特異度較低的診斷標志物作為獨立檢測指標是不可靠的。故在不同地區需重新評估P16 IHC的診斷能力[5]。

2015年，CHI等[17]推薦以下方案來評估HPV的狀態：①對于完全或大部分非角質化的腫瘤，P16高度且彌漫(即70%以上細胞質和細胞核)表達時，足以指示HPV陽性，不需要再進行HPV DNA檢測；若P16陰性或者局部陽性表達時，則需要進行HPV DNA檢測；②對于角質化腫瘤，P16高度且彌散表達時，需要進行HPV DNA檢測；若P16陰性或局部陽性表達時，足以指示HPV的陰性狀態，不需要HPV DNA檢測。

2020年我國《口腔癌及口咽癌病理診斷規范》中對于OPSCC患者提出了具體的推薦診斷方案。Ⅰ級推薦：所有病例均應行P16 IHC檢測，當 P16陽性細胞數≥70%、陽性表達定位于細胞核和細胞質且為中等至強陽性，且組織學形態為非角化型鱗狀細胞癌時，應報告“HPV相關性(P16+)鱗狀細胞癌”；Ⅱ級推薦：除行 P16 IHC檢測外，可行 HPV DNA或RNA檢測，對于HPV DNA或RNA檢測陽性者，應報告“OPSCC-HPV”。

2.4 體液中的生物標記物

血清、血漿和唾液中生物標記物在可獲得性、低侵入性、低成本性等方面具有優勢，對其檢測有助于疾病早期和術后復發的預測。一種基于PCR的檢測唾液中HPVE6/E7 mRNA的方法，檢測結果與P16 IHC具有高度一致性。RETTIG等[18]收集了OPSCC-HPV患者治療前后幾個時間點的唾液樣本，54%的患者在診斷時被檢測到HPV DNA，而經治療后僅約5%患者唾液中可檢測到HPV DNA。重要的是，所有治療后復發OPSCC-HPV患者均與HPV持續感染相關[18]。

研究發現HPV E6/E7血清抗體與OPSCC風險之間具有顯著相關性。KREIMER 等[19]研究發現，有34.8% OPSCC患者血清中被檢測到HPV E6抗體，而在健康對照組中僅占0.7%，值得關注的是部分診斷為OPSCC患者在10年前血清中就已檢測出存在HPV E6抗體。這可能意味著血清中HPV16 E6抗體陽性人群患OPSCC風險較高。

AHN等[20]應用PCR方法檢測了81例OPSCC-HPV患者的血漿，約有67%的樣本在治療前就檢測到了HPV DNA。CHERA等[21]利用相同技術對115例患者的1 006份血漿樣本進行了檢測，87例患者在治療后監測期間內未檢測到HPV DNA，并且均未出現復發；28例患者在治療后監測期間檢測到HPV DNA，其中15例患者經活檢證實復發；16例患者連續2次HPV DNA血漿檢測陽性，其中15例經活檢證實復發。這些數據對于早期發現腫瘤復發和開展進一步治療非常有幫助。

3 結語

生物標志物是指可以提示系統、器官、組織、細胞及亞細胞結構或功能的改變或可能發生改變的生化指標，具有非常廣泛的用途。檢測一種疾病特異性的生物標志物，對于疾病的鑒定、早期診斷、預防和治療有著至關重要的作用。因為具有成本更低、樣本更易獲取和大眾更易接受的特點。針對唾液、血漿中HPV DNA和血清中HPV抗體的檢測，比較適用于臨床大規模的篩查和復發預測，然而其檢測結果靈敏度偏低，這可能與液態樣本中病毒含量較低或者檢測技術不成熟等有關。目前針對組織樣本的檢測主要有PCR、ISH和IHC等技術。檢測方法各有利弊，也沒有足夠的證據證明僅采用一種檢測方法就可以確診。這里需要注意的是，要將一種檢測方法應用于臨床實踐，需要的不是靈敏度高到可以檢測到少量HPV(可能來自無關的感染或污染)，而是要證明病毒的轉錄活性是否已經可以導致癌癥，同時要結合 OPSCC-HPV 臨床表現。因此，當前較多學者提出了多模態檢測，其原理是利用單個檢測的優勢來優化HPV檢測結果整體可靠性。

總而言之，未來OPSCC-HPV的檢測應該滿足非侵入性、低成本及易操作的特點，從而做到早診斷、早治療，以提高患者的總體生存率。