全基因組測序技術在結核病病原學診斷和監測中應用的研究進展▲

2021-03-26 10:42:07林定文崔哲哲

廣西醫學 2021年7期

林定文崔哲哲

(廣西壯族自治區疾病預防控制中心營養與學校衛生所，南寧市 530028，電子郵箱：drldw@163.com)

【提要】中國政府在《遏制結核病行動計劃(2019-2022年)》中提出，各地要提高結核病實驗室診斷能力，縮短診斷時間，病原學陽性的肺結核患者耐藥篩查率應達90%以上，最大限度發現耐藥結核病患者。但目前傳統的檢測方法不但耗時長，而且精確度有限。微生物全基因組測序技術是近年來興起的結核分枝桿菌菌種鑒定、耐藥檢測和公共衛生監測手段。本文對近年來全基因組測序在結核病病原學診斷和監測領域中的研究進展進行綜述，以評估其在國內的應用價值和前景。

結核病是一種由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的慢性傳染病[1]。目前，結核病疫情形勢依然嚴峻，2018年全球約有1 000萬例新發結核病，結核病死亡人數約150萬(其中包括25.1萬HIV陽性患者)[2]。我國是全球結核病高負擔國家之一，結核病疫情呈高患病率、高耐藥率、高死亡率、高感染率等特點[3]。為此，中國政府在《遏制結核病行動計劃(2019-2022年)》[4](下稱《行動計劃》)中明確了履行“終止結核”國際承諾的行動目標。《行動計劃》提出，各地要提高結核病實驗室診斷能力，縮短診斷時間；病原學陽性的肺結核患者耐藥篩查率應達90%以上，最大限度發現耐藥結核病患者。為實現上述目標，中國政府要求相關部門開展集診斷、治療和預防于一體的綜合干預措施，并總結出可復制可推廣的防控新模式和新策略的行動綱領。同時，應加快結核病診療管理的信息化建設，逐步提高醫療機構、疾控機構和基層醫療衛生機構患者診療服務的精準性、時效性以及各機構之間信息的互聯互通[4]。現就目前全基因測序(whole-genome sequencing，WGS)技術在結核病病原學診斷和監測中的應用研究進展進行綜述。

1 分枝桿菌的復合群分類

分枝桿菌種類繁多，按菌群可分為MTB復合群、麻風分枝桿菌、非結核分枝桿菌(Nontuberculosismycobacteria，NTM)[5]。MTB簡稱為結核桿菌，早在1882年，德國細菌學家柯赫就已證實MTB是導致結核病的病原菌[1]。NTM是分枝桿菌屬內除MTB復合群和麻風分枝桿菌以外的其他分枝桿菌[6]。迄今為止，共發現約160種NTM，大部分營腐生或營寄生，少部分對人體致病。NTM可侵犯肺臟、淋巴結、骨骼、皮膚和關節等組織器官[7]。近年來，NTM感染的發病率呈快速升高趨勢[8]。在我國浙江、福建、廣東等沿海省份的部分地區，因NTM導致的結核病患者占全部結核病患者的10%～25%[9]。由于分枝桿菌各菌種的生物學特性、致病性、耐藥性等特點不盡相同，對菌種進行鑒定對于分枝桿菌及其所致疾病的基礎研究、預防和治療具有十分重要的意義。

2 傳統菌種鑒定和監測技術瓶頸

準確及時地鑒定分枝桿菌、獲取藥敏信息，對有效地控制傳染源、預防結核病至關重要[2]。通常MTB及其耐藥性檢測依賴于生物安全三級實驗室中液體或固體培養基的培養。傳統的L-J固體培養方法簡單、經濟，易于推廣，但是培養周期長(8～12周)[10-11]。BACTEC MGIT 960是美國BD公司在不斷完善BACTEC MGIT 460TB技術的基礎上建立的新一代液體培養熒光檢測系統[12]，其陽性檢出率和培養時間均較涂片和L-J培養基具有明顯的優勢，可縮短報告時間，應用價值獲得全球廣泛認可[13]。目前，國內的結核病臨床實驗室大多采用對硝基苯甲酸和噻吩二羧酸肼培養基生長試驗，對分枝桿菌培養陽性的菌株進行鑒定。其中，在硝基苯甲酸和噻吩二羧酸肼兩種培養基上均生長的細菌為疑似NTM；只在其中一種培養基上生長或者在兩種培養基上均不生長的細菌則認為是MTB復合群[5]。對于疑似NTM，可以使用16S rRNA基因擴增測序后全局比對標準DNA序列的方式進行菌種判定，一般認為序列一致性達到97%以上為同種細菌[14]。根據序列比對的結果，培養基長生試驗篩選得到的疑似NTM仍有一小部分可能是MTB，也可能是諾卡氏菌。由于分子診斷得到的結果比培養基長生試驗更可靠，目前已有部分醫療機構使用基因芯片或分子探針進行NTM的診斷，其檢測的分子靶標覆蓋16S rRNA、hsp65等基因，但目前的研究結果提示單個基因(如16S rRNA基因)的分辨率只能鑒定到同屬，而無法完全鑒定到同種[15]。而無論是菌種鑒定還是藥敏試驗，這些傳統技術均具有簡單、經濟等優勢，但耗時較久，操作復雜且結果不穩定，可重復性差，遠不能滿足快速準確檢測的需要[16]。

在病原監測方面，結核病是我國法定報告的乙類傳染病。由于目前所使用的技術手段和報告方式具有局限性，肺結核聚集性疫情的發現大多依賴于回顧性的流行病學研究。對于疾控部門而言，疫情暴發的早期識別和預警，乃至早期的干預控制，依然是結核病防控的難題。這種困難體現為：由于分辨率低，病原分型信息無法支持決策，同時也無法在建立診斷的第一時間獲得；現場流行病學信息往往缺失或者失真，而公共衛生事件的預警不足和處置不當會導致其演變為公共衛生危機事件，影響社會穩定。在臨床診斷方面，正如《行動計劃》提出的2022年定點醫院能力建設目標，目前我國的基層(市級和以下)定點醫院依然缺乏必要的病原學診斷能力，上述現有的實驗室技術經多年的推廣后仍不具有足夠的可及性。按目前制度要求和人員、設備的現狀，縣級結核病定點醫院開展痰涂片、痰培養時，陽性標本或培養物需送市級相關機構開展菌種鑒定和藥敏培養，這導致實驗結果報告所需時間長，患者常得不到及時、精準的治療，同時較長的結果等待期也使患者的耐心耗盡，甚至失訪。此外，在標本上送運輸的過程中，標本的活性和生物安全存往往也得不到保障。因此，目前傳統菌種的鑒定和監測依然困難重重，尚不能利用現有傳統技術手段及時、準確地診斷和防治結核病。

3 WGS技術在結核病病原學診斷和監測中的應用

隨著微生物基因組流行病學的興起和高通量測序技術的發展，上述傳統手段無法解決的問題有望得到解決。WGS技術的優勢在其是目前分辨率最高的分子分型和鑒定技術，并且可以一次性考察所有關注的病原信息點，包括病原的物種、亞型以及毒力基因、抗生素抗性等特性，且實驗數據容易標準化以進行室間評價、歷史數據比較等。

微生物基因組學技術應用于結核病病原學的診斷和監控，一方面能滿足結核病全面、快速、可靠的病原學診斷的需要；另一方面其高分辨率的優勢能滿足結核病流行病學的調查與控制[17-18]。將結核病的診斷與控制工作合二為一(診防一體)，充分利用有限的資源，有利于實現控制結核病疫情的目標。隨著WGS技術的成熟，一些公共衛生機構，如美國疾病預防控制中心和食品藥品監督管理局，已經在嘗試使用全基因組序列比對——DNA-DNA雜交的數字化模擬手段作為細菌鑒定的“金標準”。2013年，K?ser等[19]使用WGS技術成功將結核桿菌的檢驗時間從幾周縮短到幾天，這表明WGS應用于結核病病原菌的診斷具有很高的可行性。2015年7月，Brown等[20]首次在未培養的痰液樣本中成功進行MTB基因組測序，但由于操作復雜并且成本較高，目前難以滿足實際應用的需求。

我國專家在最近發表的專家共識中，明確了結核病聚集性疫情調查時WGS技術在病原學分子分型中的應用價值[21]。同時，隨著測序價格的持續降低，WGS技術的費用已經可以被發展中國家的一線檢驗或流行病監控工作所接受。但也有專家認為，在WGS技術廣泛應用之前，仍需要大量的標準化和驗證性的工作，尤其是在高負擔的發展中國家[22]。

4 WGS技術在耐藥檢測領域中的應用

美國疾病預防與控制中心指出，快速靈敏的MTB培養和藥敏試驗是控制結核病的首要條件[18]。利福平是治療結核病最有效的藥物之一，然而根據世界衛生組織的報告，2018年新發結核病患者中約有48.4萬例利福平耐藥患者，其中78%為多重耐藥結核病，耐藥結核病已成為全球結核病治療和預防所面臨的最大威脅之一[2]。MTB的耐藥問題已成為全球關注的熱點問題[23-25]，也是我國結核病防治工作中面臨的挑戰之一，廣泛耐藥結核病的成功診斷和治療取決于是否獲得全面、準確的藥物敏感性試驗結果。但藥敏檢測結果需要數周甚至數月的時間才獲得，并且許多地區缺乏所需的實驗室條件和資源，即使在資源充足的國家，傳統的方法完成所有檢測通常也需要1～2個月，藥敏周期長也可能導致藥敏結果出現偏差[26-27]。此外，培養法藥敏表型檢測的準確性和重復性通常較差，特別是對于吡嗪酰胺等藥物[28]。因此，臨床實驗室亟須引入快速的分枝桿菌藥敏試驗方法。

隨著MTB耐藥分子機制逐漸被闡明，通過檢測耐藥基因突變來快速診斷耐藥結核病日益受到重視[29-31]，分子檢測的使用頻次不斷增加。我國于2017年將分子診斷技術納入了肺結核的診斷標準之一，大幅提高了結核病病原識別和耐藥監測的效率[32]，目前已經有商品化的Gepheid Gene Xpert MTB/利福平以及Hain GenoType MTBDRplusand MTBDRsl被證明可以縮短結核病患者診斷并開始治療的時間[33]。雖然這些技術可以使越來越多的耐藥結核病患者被盡早發現和治療，但仍存在重要的診斷缺口。2018年經細菌學確診的結核病患者接受利福平耐藥性檢測的比例為51%，而2018年接受治療的耐多藥及僅利福平耐藥患者(156 071例)僅占罹患耐多藥及僅利福平耐藥(約50萬)患者的1/3[3]。已有的分子檢測技術能快速鑒定耐藥菌株或進行部分藥敏檢測，但只能檢測微一小部分的生物基因組，不能滿足全部的檢測需求[26-27,33]。因此，迫切需要能提供結核病菌株全面耐藥信息的快速診斷技術，以彌補現有技術的不足。

其他分子檢測技術通過探針或特定基因序列雜交的方法可以間接鑒定MTB或檢測有限的耐藥突變信息，而WGS技術可以檢測全部基因序列信息，包括其他分子檢測技術可能無法識別的插入、缺失或者罕見突變等序列層面的信息，例如異質性耐藥或者混合感染[34]，并且可多次檢測每個DNA堿基。因此WGS技術為耐藥結核病的檢測提供了一個強有力的選擇，其可以提供更準確的深度基因多態性檢測，目前已經有多種WGS平臺可以用于耐藥結核病的診斷。

耐藥結核病的流行病學監控、公共衛生干預和控制依賴于全面、快速、準確的檢測，包括MTB復合物鑒定、藥敏檢測和細菌基因分型。WGS技術能提供更全面的結果，在一次試驗中完成菌種鑒定、藥敏檢測和基因分型，但受限于結核桿菌樣本的核酸總量，需要對原始樣本進行一定的培養[27,35-36]。Coll等[37]的研究顯示，與使用商品化的分子探針法相比，使用WGS技術對結核病的病原體進行耐藥檢測具有相似或更高的敏感度，這表示WGS技術有取代目前廣泛應用的分子探針法的可能。同時，Coll等[38]也成功將高分辨率的WGS技術應用于MTB的分子分型上。2018年，德國結核參比實驗室評估了Cepheid GeneXpert MTB/利福平、線性探針檢測(Hain GenoType MTBDRplus2.0 and MTBDRsl2.0)及WGS 3種分子藥敏檢測技術對多耐藥、廣泛耐藥結核病治療效果的影響，結果顯示，WGS技術可用于判斷復雜的耐藥，與基于藥敏表型檢測結果建立的治療方案相比，WGS技術的處方一致性最高，有利于為患者提供更合適的治療方案[39]。

一項橫跨6大洲16個國家、10 209個菌株的研究顯示[40]：利用WGS技術能夠準確判斷抗結核藥物的敏感性，WGS技術的敏感性、特異性可以滿足臨床應用需要；同時，WGS技術能像藥敏表型檢測法一樣提示不應使用哪種藥物而應該使用哪種藥物治療。在日常使用WGS技術進行結核菌診斷時，還能降低培養法和表型分析等的工作量[40]。英國、荷蘭以及美國的公共衛生當局已經決定，當WGS檢測顯示受試菌株對一線抗結核藥物敏感時，將不再使用藥敏表型檢測法進行分析，這一系統性的改變節省了大量的費用和時間[40]。為指導新的基因組學技術的實施應用，世界衛生組織在2018年發布了WGS技術用于MTB耐藥檢測的技術指南，該指南總結了WGS技術的特點以及相關技術的發展現狀，以指導中等收入和低收入國家建設WGS平臺體系，從而用于診斷結核病的耐藥性[40]。WGS技術以其顯著的優勢，逐漸改變結核病尤其是耐藥結核病的診斷流程。隨著WGS技術在臨床中的廣泛應用，藥敏表型檢測的應用將會減少，尤其是藥敏表型法檢測結果不可靠的藥物，例如吡嗪酰胺。另外，在沒有藥敏表型法檢測能力的地區，同樣可以使用WGS進行全面、快速、低成本的檢測[41]。

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