細(xì)胞自噬與肝細(xì)胞癌的研究進展

吳 娜，王 東，白咸勇

(濱州醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，山東 煙臺 264003)

肝癌是中國常見的惡性腫瘤之一，其中肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占原發(fā)性肝癌的90%。目前治療肝癌的方法主要是手術(shù)切除和肝臟移植，但多數(shù)患者確診時已是肝癌晚期[1]，手術(shù)治療意義不大。索拉非尼作為一種多激酶抑制劑，是中晚期肝癌患者治療的一線全身靶向藥物，然而耐藥性和副作用卻降低了在臨床使用的益處[2]。因此，耐藥性和腫瘤易發(fā)生轉(zhuǎn)移等特點是限制HCC治療的重要原因。

細(xì)胞自噬作為機體的一種保護性機制，通過依賴溶酶體降解細(xì)胞質(zhì)內(nèi)破損的細(xì)胞器，致病性微生物和錯誤折疊的蛋白質(zhì)，從而維持真核細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。根據(jù)物質(zhì)與溶酶體融合方式不同分為以下3種：分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autophagy)、微自噬(microautophagy)和大自噬(macroautophagy)[3]。本文就自噬在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，討論大自噬與肝癌治療之間的關(guān)系。

1 細(xì)胞自噬的機制

從20世紀(jì)90年代在酵母中首次發(fā)現(xiàn)自噬，自噬就一直扮演著重要角色，而它的完成需要大量自噬相關(guān)基因(autophagy related gene，ATG)[4]參與。不同ATG翻譯后的蛋白質(zhì)執(zhí)行不同的功能，負(fù)責(zé)調(diào)控自噬的不同階段。

自噬的形成分為以下5個階段[5-6]：起始、延伸、成熟、融合和降解。饑餓處理時，AMPK先是激活ULK1/2蛋白招募自噬相關(guān)蛋白13 (ATG13)、ATG101和FIP200，組成膜復(fù)合物形成自噬囊泡的起始部分；緊接著AMPK激活參與VPS34復(fù)合物(Beclin-1、ATG14和VPS34)的酶形成VPS34膜復(fù)合物，以完成自噬囊泡的延伸；接下來，在兩個泛素樣ATG4B-ATG7-ATG3復(fù)合物和ATG12-ATG5-ATG16L復(fù)合物的介導(dǎo)下，促使LC3Ⅰ與磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合形成LC3Ⅱ，完成LC3脂化形成完整的自噬小體，即自噬的成熟階段。在此過程中，LC3的活性受轉(zhuǎn)錄因子TFEB和FOXO3a的控制。完成脂化的LC3Ⅱ存在于自噬小體膜形成的整個過程，因此LC3Ⅱ是檢測自噬小體的標(biāo)準(zhǔn)蛋白[7]。成熟的自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，利用溶酶體酸性水解酶的作用降解清除受損的細(xì)胞器或蛋白質(zhì)進行回收利用。

然而，與以往的大自噬不同。自噬除依賴溶酶體在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)降解物質(zhì)外，還發(fā)現(xiàn)了一種新的自噬分泌途徑。以LC3為結(jié)合機制，包裹RNA結(jié)合蛋白和小的非編碼RNA進入胞外囊泡在細(xì)胞外分泌，提示這種新的自噬機制可能與細(xì)胞間信號傳導(dǎo)有關(guān)[8]。

2 細(xì)胞自噬與肝癌發(fā)生

一方面，自噬通過清除受損的細(xì)胞器以維持正常的肝細(xì)胞代謝，防止肝損傷和腫瘤的發(fā)生。完整的自噬過程，需要多個自噬基因的參與。如BECN1已被證明是一種抑癌基因。敲除小鼠BECN1基因，會導(dǎo)致小鼠自噬形成減少，體內(nèi)細(xì)胞增殖增加，進而小鼠自發(fā)性腫瘤發(fā)生概率升高。同樣，乙型肝炎病毒誘導(dǎo)的癌前病變小鼠模型也快速發(fā)展成肝癌[9]。另外，敲除小鼠肝特異性ATG7或ATG5[10]，會引起小鼠炎性反應(yīng)，出現(xiàn)肝腫大，肝臟損傷加重并最終發(fā)展為HCC。同時，在ATG5敲除的小鼠中還發(fā)現(xiàn)Nrf2持續(xù)激活，導(dǎo)致SQSTM1/p62蛋白積累，而p62蛋白的積累是引起肝臟受損和肝癌發(fā)生的主要原因[11]。這些不僅說明自噬能夠抑制肝癌的發(fā)生，還在維持肝內(nèi)穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用。

另一方面，自噬是導(dǎo)致HCC耐藥性的重要機制[12]。在腫瘤細(xì)胞快速增殖和轉(zhuǎn)移階段，自噬幫助肝癌細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)視，抵抗應(yīng)激條件，維持腫瘤細(xì)胞生存。因此，進一步探究自噬在HCC中的調(diào)控是治療HCC的關(guān)鍵。

3 細(xì)胞自噬與肝癌治療

近些年，隨著對自噬深入研究，大量研究表明腫瘤細(xì)胞可通過自噬在營養(yǎng)不良和低氧的腫瘤微環(huán)境中存活，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生抵抗力。因此，肝癌治療藥物和自噬調(diào)節(jié)劑聯(lián)合使用可以克服化療藥物的耐藥性，一些靶向自噬途徑的小分子有望成為抗肝癌藥物。

3.1 自噬抑制劑

如果腫瘤沒有血液供應(yīng)，就無法維持增殖，因此形成新血管對腫瘤維持增殖至關(guān)重要。目前，通過開發(fā)各種血管生成抑制劑來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但細(xì)胞失去血液供應(yīng)引發(fā)缺氧后，機體會發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)自噬，而自噬水平的升高有助于腫瘤細(xì)胞在低氧環(huán)境下存活，并且產(chǎn)生抵抗力[13-14]。因此，自噬是抗血管生成治療效果差和獲得耐藥性的機制之一。故聯(lián)合使用抗血管生成藥物和自噬抑制劑為促進細(xì)胞凋亡提供新思路。

3.1.1 氯喹：氯喹(Chloroquine，CQ)或羥化氯喹為FDA批準(zhǔn)用于臨床試驗的自噬抑制劑，主要通過破壞溶酶體的酸性環(huán)境，抑制溶酶體和自噬小體融合，阻斷正常的自噬過程。使用氯喹抑制自噬可以增強腫瘤細(xì)胞對環(huán)境的敏感性，進而增強化療藥和靶向治療藥物的細(xì)胞毒性從而促進腫瘤細(xì)胞凋亡。氯喹和索拉非尼的聯(lián)合使用，能顯著抑制體內(nèi)和體外HCC的增殖[13]。

3.1.2 LY294002、3-MA和Wortmannin：LY294002、3-MA和Wortmannin都屬于PI3K抑制劑，都是通過抑制PI3K-Ⅲ與BECN1結(jié)合形成膜復(fù)合物，從而抑制自噬小體起始部分的形成[13]。在肝癌細(xì)胞中使用3-MA或者沉默BECN1的表達(dá)抑制自噬，再加索拉非尼聯(lián)合使用，能夠增強肝癌細(xì)胞對索拉非尼的敏感性，促進腫瘤細(xì)胞死亡[15]。目前，LY294002、3-MA和Wortmannin作為自噬抑制劑廣泛應(yīng)用于實驗中。

3.1.3 BafilomycinA1：BafilomycinA1和氯喹同樣是阻止自噬小體與溶酶體融合，但與氯喹不同的是，BafilomycinA1是H+-ATP酶(V-ATPase)的化學(xué)抑制劑，其中V-ATPase活性對維持溶酶體酸性環(huán)境和水解酶活性至關(guān)重要[16]，而自噬小體和溶酶體融合后的降解也主要依賴溶酶體酸性環(huán)境。去除BafilomycinA1的影響后，自噬動態(tài)過程將繼續(xù)進行下去。BafilomycinA1已作為自噬小體和溶酶體分離的標(biāo)志物。

3.1.4 E64d+和PepstatinA：與以上自噬抑制劑不同，E64d+和PepstatinA是蛋白酶抑制劑[17]，兩者以1∶1比例聯(lián)合使用，通過抑制溶酶體水解酶，阻斷自噬溶酶體降解，但對自噬小體的形成沒有影響。

3.1.5 自噬抑制劑與其他藥物聯(lián)合：自噬抑制劑可以增強腫瘤細(xì)胞的敏感性，可以利用這種作用與其他方法聯(lián)合治療肝癌。光熱療法是近年來發(fā)展起來的一種新的治療HCC方法，利用光熱療法聯(lián)合自噬抑制劑氯喹二磷酸共同處理肝癌細(xì)胞株HepG2，結(jié)果細(xì)胞凋亡數(shù)量較對照組和單獨光熱療治療組增多。此外，自噬抑制劑顯著增強了小鼠異種移植瘤模型對腫瘤增殖的抑制作用[18]。蛋白酶體抑制劑硼替佐米可以與自噬抑制劑氯喹協(xié)同作用誘導(dǎo)Huh-7細(xì)胞凋亡，并抑制腫瘤細(xì)胞增殖[19]。以上表明，抑制肝癌細(xì)胞自噬，能夠有效抑制肝癌細(xì)胞抵抗應(yīng)激的能力，再與其他治療方案聯(lián)合起到協(xié)同作用，增強細(xì)胞毒性，從而促進肝癌細(xì)胞凋亡。

3.2 其他與自噬相關(guān)的藥物

3.2.1 HDACs抑制劑：在肝癌細(xì)胞中，有4類組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)過度表達(dá)，抑制抑癌基因的表達(dá)。因此，組蛋白去乙酰化酶抑制劑(HDAC inhibitors，HDACis)能夠促進癌細(xì)胞中的抑癌基因的表達(dá)，進而成為潛在的抗癌藥物。兩種強效HDAC抑制劑SAHA和OSU-HDAC42通過下調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和PI3K/AKT/m-TOR信號通路激活肝癌細(xì)胞自噬，導(dǎo)致大量肝癌細(xì)胞死亡[20]。目前，已有兩種HDACis藥物應(yīng)用于II期臨床，增加一線治療藥物如索拉非尼的抗癌效果，從而使癌細(xì)胞對化療和放療敏感。因此，抗癌藥物與自噬誘導(dǎo)藥物的結(jié)合可能對治療肝癌來說也是一種策略。但這與前面提到的自噬抑制劑不同的是激活超過一定閾值的自噬將導(dǎo)致細(xì)胞功能崩潰，而自噬泡的大量積累將引起自噬性細(xì)胞死亡。

3.2.2 天然提取物：近些年，在一些天然提取的植物化學(xué)物質(zhì)中，如姜黃素、熊果酸和白藜蘆醇等能夠通過自噬途徑抑制腫瘤細(xì)胞增殖。白花丹醌(plumbagin)是從白花丹根部提取出來一種具有活性的萘醌化合物。無論在體內(nèi)還是體外實驗中，白花丹醌可以提高SMMC-7721細(xì)胞自噬基因LC3、ATG5、BECN1和ATG7的表達(dá)，并誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。而加入自噬抑制劑3-MA處理可阻斷白花丹醌誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡形成[21]。SM1044作為一種新的水溶性青蒿素衍生物，能激活神經(jīng)酰胺的從頭合成，從而通過鈣或鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶2(CaMKK2)-AMPK-ULK1軸啟動自噬，誘導(dǎo)自噬依賴性細(xì)胞凋亡[22]；Anemoside B4(AB4)是從白頭翁(pulsatilla chinensis,P.chinensis)中提取的化合物。AB4通過調(diào)節(jié)Bcl-2-caspase-3通路和BECN1-LC3-p62通路，抑制了PI3K/AKT/mTOR信號通路，誘導(dǎo)肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡和自噬[23]。以上，無論誘導(dǎo)自噬或促進自噬，都可能是促進肝癌細(xì)胞凋亡的機制。而具體是哪一種機制，還需要進一步的探究。

4 展望

自噬作為一種自我消化程序，是調(diào)節(jié)細(xì)胞器和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，保證細(xì)胞在各種應(yīng)激條件下的生存機制。在肝癌中，自噬是確保肝癌細(xì)胞抵抗應(yīng)激條件，從而適應(yīng)腫瘤微環(huán)境的關(guān)鍵因素。然而，由于肝癌發(fā)展的多樣性，自噬在肝癌中的具體機制仍不確定。一方面，自噬可以保護正常肝細(xì)胞免受外界刺激，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。另一方面，自噬幫助肝癌細(xì)胞躲避免疫監(jiān)視產(chǎn)生抵抗力。以自噬作為靶點，選擇合適的自噬調(diào)節(jié)劑個性化治療成為肝癌治療的一大難題。因此積極探索自噬在肝癌發(fā)生發(fā)展的機制，有望成為治療肝癌的希望。而通過靶向自噬途徑將是一種很有前景的肝癌治療方案，以期克服耐藥性促進肝癌細(xì)胞死亡，也為推動醫(yī)學(xué)發(fā)展開發(fā)新型藥物提供新思路。