從臨床前和臨床研究談肝癌免疫治療新進展

蔣貝格 周偉平

肝細胞癌(HCC)是世界范圍內致死率最高的惡性腫瘤之一，目前尚無針對發病機制為基礎的有效治療[1]。HCC對化療不敏感，且手術切除、局部射頻消融等治療效果有限[1]。雖然，目前已有不少治療肝癌的靶向藥物出現，譬如索拉非尼(Sorafenib)、侖伐替尼(lenvatinib)，但治療效果非常有限，也僅延長了患者幾個月的生存期[2,3]。因此，隨著免疫檢查點抑制劑(ICIs)在晚期黑色素瘤或肺癌上取得不錯效果后，ICIs在未進行臨床前試驗的情況下，隨即進入臨床試驗治療晚期肝細胞癌。結果顯示，藥物的毒性和安全性可控，但治療效果相對有限，治療反應率不高。因此，一個亟待解決的問題出現了，那就是如何把肝臟腫瘤從“冷”向“熱”，或者說有不錯反應率的腫瘤轉變，這需要深度的動物模型機制研究和大樣本的人體試驗數據。

近年來，隨著免疫抑制共受體在T淋巴細胞中被發現，通過增強免疫抑制腫瘤才取得真正的突破。比如，在預先皮下注射了結腸腫瘤51BLim10細胞或Sa1N纖維肉瘤細胞的小鼠腹腔內注射抗CTLA-4抗體，而非抗CD28抗體，抑制了小鼠體內的腫瘤生長[4]。細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4 (CTLA-4)，又稱為CD152，通過與CD28的配體CD80(B7-1)和CD86(B7-2)結合，負向調節T細胞活性[4]。程序性細胞死亡蛋白-1(PD-1)通過與其特異性配體PD-L1(B7-H1，CD274)和PD-L2(B7-DC，CD273)相互作用，抑制T細胞的活性和增殖[5]。Honjo等在小鼠體內證實，P815肥大細胞瘤表達程序性細胞死亡蛋白-1(PD-1)后能顯著增強細胞的成瘤性和侵襲性[5]。這些開創性的研究表明，通過阻斷免疫抑制信號可以抑制腫瘤。很快腫瘤免疫療法進入臨床試驗。一家創新型小公司Medarex研制了人源化的抗PD-1抗體(nivolumab)。2006年，被美國FDA批準進入臨床試驗，2008年日本也開展相關臨床試驗。到2012年，人源化的抗PD-1抗體治療非小細胞型肺癌、黑色素瘤、腎細胞癌的I期臨床試驗結果被相繼報道[6]。當這種腫瘤免疫療法成功地挽救了一些晚期轉移性黑色素瘤和腎癌的患者時，全世界都為之興奮。2013年Science雜志將腫瘤免疫治療評選為當年的十大科學突破。本文將重點回顧闡述動物模型結合臨床前研究以及臨床試驗研究在促進HCC免疫治療中的價值。

一、ICIs在肝癌患者中的臨床試驗

2013年，Sangro等報道了CTLA-4抗體(tremelimumab)治療HCC的無對照、開放標簽、多中心的II期臨床試驗[7]。該臨床試驗在20例由丙型肝炎引起肝硬化最終發展成為HCC患者身上進行，結果顯示CTLA-4抗體有抗腫瘤和抗病毒效應，且藥物的不良反應可控。2017年，El-Khoveiry[8]報道了其與多名全球合作者共同開展了一項抗PD-1抗體(nivolumab)治療晚期HCC(CheckMate040)的開放標簽，非比較性的I/II期臨床試驗(NCT01658878)。該臨床研究共招募262例多病因導致的晚期HCC患者。結果表明，無論是否接受過索拉非尼治療，nivolumab都有不錯反應率和總體生存時間，且藥物安全可控。

一項非隨機，開放標簽的II期臨床試驗(Keynote-224)評估了抗PD-1藥物pembrolizumab治療104例接受過索拉非尼治療的晚期HCC患者的安全性和有效性，結果表明，Pembrolizumab也沒有發現嚴重的安全性和毒性的事件[9]。對這些HBV或HCV感染史且索拉非尼治療后發生病情進展的HCC患者的客觀反應率為17%。最常見的免疫相關不良反應有甲狀腺功能減退，腎上腺功能不足，以及甲狀腺炎，這些不良反應與Pembrolizumab治療其他腫瘤出現的一樣。PD-L1在腫瘤和免疫細胞中的聯合表達可預測pembrolizumab的反應性。20%(6/30)低表達的PD-L1的患者，也對抗PD-1治療有效。全球，仍有很多ICIs治療HCC的臨床試驗正在開展中，每年都有新的臨床試驗結果出來。其中包括兩個二線治療晚期肝癌的III期臨床試驗(KEYNOTE-240和KEYNOTE-394)。不少臨床試驗旨在評估抗CTLA-4和PD-1或PD-L1聯合其他藥物或者物理治療的聯合治療策略[10]。

二、肝臟中的特殊免疫微環境

最初的臨床試驗結果顯示，免疫治療在HCC中展現出較低的反應率和有限的治療益處[8, 9]。因此，在探討可能影響臨床結果的分子、細胞因素時，不能忽視肝臟免疫耐受。肝臟在免疫調節中起著重要的作用。從腸道，除了營養物質外，肝臟還獲得能被肝臟獨特的“肝竇”結構有效識別、加工或清除的物質，包括微生物、微生物相關分子模式(MAMPs)和損傷相關分子模式(DAMPs)。相應地，肝竇內皮細胞(LSECs)表達一系列模式識別受體(PRRs)，負責清除血液中的可溶性大分子和膠狀廢物[11]。另外，肝臟里常駐著數量最多的庫普弗細胞，它們也表達多種類型的PRRs，通過吞噬作用識別和清除不溶性的廢物。肝臟的另外一個顯著特征是富含NK，NKT和TCRγδT細胞，以及相對外周血CD8+/CD4+T細胞比例更高。

肝臟最重要的免疫特性之一是誘導T細胞耐受導致肝臟免疫耐受，從而防止對從腸子吸收的抗原的過激免疫反應。雖然，潛在的機制仍有待闡明。肝臟的免疫抑制環境顯然是由原始T細胞、LESCs、樹突狀細胞，枯否氏細胞和肝細胞通過促炎和抑炎細胞因子的相互協調維持的[12]。肝臟T細胞的耐受是在缺少共刺激因子和CD4+細胞數量少，或由枯否氏細胞分泌的IL-10刺激導致的Treg細胞擴增的環境下被持續的抗原遞呈而誘導產生[12]。盡管這些免疫抑制對維持肝臟內環境的穩態至關重要，但這也可能造成HCC的免疫逃逸。

三、原發性肝癌的免疫概況

肝臟惡性腫瘤通常在慢性壞死性炎癥的情況下發生，其特征是細胞死亡，代償性再生，肝星狀細胞(HSCs)過度活化和纖維化，以及侵潤的炎癥細胞和淋巴細胞的功能改變。在HCC患者中檢測到與全身炎癥反應相關的自發性腫瘤消退，表明肝癌至少有一些基礎免疫原性[13]。另外，據估計，超過一半的HCC患者對腫瘤相關抗原NY-ESO-1自發地產生免疫反應。經皮酒精注射療法針和射頻消融(radiofrequency ablation ，RFA)能誘發T細胞對腫瘤組織的侵潤[14]。

在人的肝癌樣本中，耗竭性CD8+T細胞和Treg細胞增多，且存在克隆擴增[15]。還檢測到了一系列已知的和特征不明顯的耗竭相關基因。膜蛋白Layilin在活化的CD8+T細胞和Treg細胞中上調，體外實驗發現其可以抑制原始CD8+T細胞產生干擾素γ，該現象與不良預后相關。對泰國的HCC/ICC患者進行大范圍基因表達譜檢測，發現在癌和癌旁組織之間發現免疫抑制基因，包括PD-L1、PD-1、CTLA-4、TIM3、B7H3和LAG3[16]。

在小鼠模型中，由β-連環蛋白CTNNB1突變導致的肝臟腫瘤對抗PD-1治療反應率低[17]?？赡艿臋C制是，Wnt/β-catenin通路的異常激活導致趨化因子，特別是CCF5的表達受損，引起募集樹突狀細胞和CD8+T細胞進入肝臟受損。這些受損/缺陷引發HCC的免疫逃逸及對PD-1抗體的反應應答低下，這與在人類HCC中觀察到β-連環蛋白活化和抗PD-1治療抵抗的現象相一致。

四、肝臟腫瘤由“冷”變“熱”

盡管ICIs在許多癌癥中取得了顯著的效果，但發現在相當一部分癌癥患者中ICIs治療是沒有效果或僅部分有效，而且出現新的問題，即部分患者對藥物產生耐受-最初有效果的患者出現腫瘤的復發。因此，如何提高免疫治療的有效性，即把“冷”腫瘤變為“熱”腫瘤使之對藥物有反應，成為一個急迫的問題。(注：根據腫瘤細胞周圍的免疫細胞的多少，將腫瘤分為熱腫瘤和冷腫瘤。)

一般情況下，HCC對ICIs反應弱。在HCC小鼠模型中，單獨注射抗PD-L1抗體，沒有顯示出任何顯著的腫瘤抑制作用[18]。另一項在轉基因小鼠系的研究中也獲得了類似的結果[17]。因此，如何將冷肝細胞癌轉變成熱肝細胞癌是非常必要。Lee[19]意外地在小鼠中發現了聚肌苷酸-聚胞苷酸(polyIC)能夠有效地抑制腫瘤。polyIC是一種合成的雙鏈RNA，能有效地激活模式識別受體TLR3、RIG-I/MDA5和蛋白激酶PKR。通過刺激多種天然免疫細胞群，包括肝臟中的NK細胞、M1巨噬細胞和樹突狀細胞，協同激活這些天然抗腫瘤功能導致在癌前階段清除“高?！鞭D化細胞，從而防止肝癌的發生[19]。

與polyIC或PD-l1ab單獨使用相比，聯合使用polyIC和PD-l1ab對肝癌具有明顯的抑制作用，甚至對小鼠的晚期腫瘤也有顯著的抑制作用[18]。聯合治療后，發現大量的CD8+T細胞被募集并浸潤到肝臟腫瘤。值得一提的是，polyIC誘導PD-L1在LSECs中表達與與腫瘤發生無關，因為不論在健康肝臟還是荷瘤的肝臟中都能檢測上述現象。因此，這種方法與肝癌腫瘤導致的各種腫瘤免疫逃逸機制無關?？傊?，這些小鼠的臨床前數據證明了用ICIs治療肝臟腫瘤是一種可行策略。

四、展望

毫無疑問，靶向ICIs的免疫治療已經改變了腫瘤治療策略。在治療不可切除的HCC(IMbrave 150)時，atezolizumab單抗(抗PD-L1)和bevacizumab單抗(抗VEGF)的聯合治療比sorafenib索拉非尼有更好的總生存率和無進展生存率[20]。作為第一個在提高生存率上超過索拉非尼的肝癌治療策略，這項研究為聯合免疫治療提供了巨大的希望。

對HCC免疫治療進行有效設計時，必須解決兩個關鍵問題：肝臟腫瘤細胞免疫原性的強度和促進肝癌進展的免疫逃避的具體機制。還有兩個問題值得關注，根據可靠的生物標志物篩選出患者可以提高治療的應答率，另一個更有意思的問題是使用額外的藥物將低應答或無應答的患者轉化為ICI應答者?？傊?，通過將臨床前研究與臨床研究相結合，將有助于發現新的免疫抑制分子和信號通路，為肝癌的靶向治療提供新的靶點。