人多能干細胞分化為肝細胞的新技術及其應用

馬鴻倩 鄢和新

當肝臟受到致病因素(代謝、酒精、病毒、遺傳性、癌癥、免疫、毒性或藥物相關)損害時，導致肝功能不全，發生不可修復的器官損傷，甚至危及生命。原位肝移植(OLT) 是治療肝衰竭唯一有效的方法，但供肝數量有限限制了肝移植的應用。此外，移植后的終身免疫抑制治療會增加感染、惡性腫瘤和其他不良反應發生的風險。

人工肝系統可以作為OLT的一種有效過渡替代治療，然而，該系統無法實現肝臟代謝功能以及患者血漿中重要的生物活性物質被吸附清除這兩個缺陷限制了它的長期使用。目前正在開發的生物人工肝(BALs)是指在生物反應器中加入肝細胞來模擬人體正常肝臟，從而代替受損肝臟發揮解毒、合成和生物轉化等功能的一種體外肝功能支持系統，在肝病患者的臨床治療中有著廣闊的應用前景。

肝細胞移植也可以替代OLT用于肝臟疾病的治療，特別是當僅有肝功能缺陷而器官的結構未受到影響時(例如某些單基因遺傳病)，或者作為肝移植等待期的橋梁。然而肝病的細胞療法目前也存在許多問題亟待解決。

一、hPSC可為肝細胞應用提供新的細胞來源

PHHs是肝細胞治療的金標準，但其供應不足、成本高、增殖能力低、代謝活性喪失快，限制了它們在體外的應用。使用人胚胎干細胞(hESCs)作為細胞治療的來源會受到倫理問題的限制。2007年，山中伸彌[1]將人類成體細胞重編程得到了一種類似于hESCs的細胞，即人誘導多能干細胞(hiPSCs)。之后，更多的研究發現，可以使用不同的重編程技術和體細胞類型來獲得hiPSCs。hiPSCs的分化方法為肝臟疾病的研究和治療提供了無限的肝細胞來源[2]。盡管多能干細胞來源的肝樣細胞(PSC-HLCs)表型更接近于胎兒肝細胞，而不是成人肝細胞[3]，但它們已被有效地用于慢性肝病或急性肝衰竭動物模型的移植治療，表明這些細胞可以在體內進一步成熟[4]。這說明分化細胞缺乏成熟度可能不是它們在移植中使用的障礙。然而藥物篩選、毒理學研究以及BAL的應用都依賴于肝細胞的功能，因此需要完全成熟的肝細胞。目前已經開發了新的方法如向培養基中添加小分子、建立共培養模型和三維(3D)培養模型等來提高培養系統中PSC-HLCs的功能。

二、在2D培養系統中促進hPSC向肝細胞分化的研究

(一)小分子化合物 hPSCs的體外培養往往需要加入生長因子或細胞因子實現肝細胞的分化，研究發現一些小分子例如CHIR99021(激活Wnt/β-catenin途徑)和LY294002(PI3K抑制劑)的加入也可以提高分化效率。在內胚層分化過程中，添加維甲酸、染色質調節劑DMSO或Wnt/β-catenin途徑的Wnt反應抑制劑IWR-1也能促進hPSCs向肝系的分化。化合物E(抑制Noch通路)和SB431542(抑制TGFβ通路)可以阻止肝祖細胞向膽管細胞分化，從而有利于肝細胞的分化。與生長因子相比，這些小分子不容易發生批次變化，在藥品生產質量管理規范(good manufacturing practice，GMP)中更容易被接受。

(二)細胞外基質 肝細胞具有復雜的極化功能和極強的黏附特性，需要多種因素相互作用才能在體外維持其生理特性和功能，例如肝細胞轉運功能依賴于肝細胞的極化和細胞與基質之間的相互作用。因此，開發了人工構造(如納米纖維、薄膜或水凝膠)來模仿細胞微環境，以增強肝細胞的黏附、遷移和增殖能力。這些支架通常由膠原、殼聚糖、明膠、海藻酸鹽和瓊脂糖等天然聚合物或聚ε-己內酯和聚L-乳酸等合成物制成。

將PHH培養在兩層I型膠原或Matrigel之間，形成的結構與體內觀察到的細胞與細胞、以及細胞與基質之間的結構相似。目前已將該模型應用于hESCs，使其能夠更好地分化為最終的內胚層，增強HLC的極化功能[5]。

(三)hPSC來源肝細胞的共培養 單獨在體外培養PHHs時其功能會迅速退化，但它們與間充質干細胞或肝竇內皮細胞共培養時其白蛋白分泌功能和細胞色素活性顯著提高。因此，在PSCs分化期間，開發了一系列共培養模型如PSCs與成纖維細胞、基質細胞和肝星狀細胞的共培養。另外還有研究表明，當HLCs與人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)共同培養時，改善HLC特性的主要是共培養培養基而不是HUVECs[6]。

三、hPSC向肝細胞分化的三維培養系統

(一)三維球體 球狀體是由PHHs、肝源性細胞系或iPSC-HLCs自聚集產生的，是一種可有或沒有非實質細胞支持的三維肝臟模型。對PHHs組成的球狀體模型進行測試，確定了防止球體壞死的最大尺寸以及允許培養的最佳細胞密度等參數。在3D球體模型中培養PHHs以及hiPSC-HLCs可以延長細胞的體外培養時間，并保持特異性標志物的表達和細胞色素P450(Cytochrome P450，CYP)的活性[7]。

(二)類器官 類器官是一類由干細胞在體外培養時形成的，能夠進行自我組裝的3D微觀結構，可以模仿器官在體內的某些功能[8]。將hiPSCs與人類臍靜脈內皮細胞和人類間充質干細胞混合培養會形成一個微小的血管化3D結構，即肝芽(Liver buds)[9]。然而該類器官缺乏膽管結構，可能會阻礙這種模型的長期使用。目前開發了肝細胞與肝星狀細胞或膽管細胞共培養的系統來提高蛋白質產量。

(三)生物打印肝臟 生物打印是使用計算機控制，以細胞或細胞聚集體為原料，逐層或逐點地構建組織和器官的一種打印技術[10]。與2D培養系統相比，將hiPSC-HLCs在明膠中進行生物打印，可提高白蛋白分泌、尿素產生能力以及多種CYP的表達水平[11]。

(四)微芯片 微芯片添加了一個相當于血液流動的裝置即微流控系統，提供氧氣和營養物質并排出廢物，從而可以更好地模擬體內的細胞環境。有報道稱在芯片上創造從常氧到嚴重缺氧的氧濃度梯度，可以模擬肝臟中產生的生理氧梯度，從而用于研究體內肝臟分區的形成。與靜態系統相比，hiPSC-HLCs的3D流體芯片模型具有顯著的肝臟特異性功能，包括白蛋白和尿素的產生能力以及代謝能力[12]。

然而，生物打印肝臟和微芯片都是由人為設計和制造而成，因此它們的使用只能限制在我們對器官的認知范圍內。

(五)封裝系統 封裝是指將細胞包裹在由水凝膠制成的半透球中，其中水凝膠可以根據需要進行化學修飾以調整其孔隙大小。在該系統中，可以通過水凝珠進行營養物質、氧氣、二氧化碳的交換和信號傳遞，并且允許生長因子、代謝物和廢物的擴散以及防止抗體的入侵。將hPSCs球體或類器官封裝在海藻酸多聚-L-賴氨酸水凝珠中可以保持細胞活力，并允許其向肝細胞的分化。在小鼠中成功植入了被包裹的hiPSC-HLCs聚合體，其血液中人白蛋白的分泌水平與PHHs相似[13]。

四、hPSC向肝細胞分化的應用研究進展

(一)疾病建模 從患者活檢組織中獲得的hiPSCs分化為一種特定的細胞類型，可以進行遺傳病的體外建模，例如hiPSC-HLCs可用于膽固醇代謝調節的研究。然而這些模型的生存能力在很大程度上依賴于分化細胞的特性和功能，就肝細胞而言，模型的建立可能會受到細胞成熟不完全的限制。

使用人體類器官模擬遺傳病包括α-1抗胰蛋白酶缺乏癥和囊性纖維化[14]，然而，在大多數情況下，人們只通過研究相關蛋白的表達來研究特定突變的影響，受突變影響的下游網絡往往缺乏文獻記載。除單基因疾病外，iPSC-HLCs類器官與游離脂肪酸聯合處理可模擬非酒精性脂肪性肝病的脂質堆積和纖維化過程。

(二)毒理學研究 HLCs可以保留一些供體細胞的表型，對更罕見的表型進行可重復建模，它還兼具PHH的代謝能力以及癌細胞系的增殖能力和重復性，使用HLCs作為肝臟模型進行毒理學研究具有良好的前景。但在體內觀察到的毒性反應是由不同細胞類型之間復雜的相互作用介導的，使用單一肝細胞培養物模擬藥物誘導的肝毒性作用有限，將HLCs與支持細胞共培養可以在一定程度上延長其肝功能的維持。

(三)藥物篩選 藥物篩選是用來研發可以選擇性地與基因和基因產物相互作用的藥物，或者可以干擾特定分子機制的藥物，以便將這些藥物用于人類臨床試驗。藥代動力學和藥效動力學知識的運用在藥物篩選中至關重要。使用2D模型篩選的過程中，塑料吸附等現象可能會影響劑量和藥物效應的關系。三維球體、類器官和器官芯片更適合用于研究藥物的藥代動力學曲線。

(四)生物人工肝 BALs的原理是將患者血漿通過體外循環與生物反應器中的人肝細胞進行物質交換，短時間替代肝臟工作，并促進受損肝臟再生修復，可幫助部分肝衰竭患者恢復肝功能。BALs需要大量的肝細胞來維持患者的血液透析和肝臟功能，PSC-HLCs可以作為其中的生物成分，但它們的長期生存能力低，以及生產成本高阻礙了其快速應用。

(五)組織工程的臨床應用 由于健康供體組織的數量有限，以及組織排斥反應存在風險，再生醫學的應用受到了一定程度的限制，使用同基因或人類白細胞抗原(HLA)相容的hiPSC-HLCs可以克服這一障礙。一種方法是將hiPSCs接種到脫細胞的人肝細胞外基質支架上進行分化，與標準分化相比，使用肝臟脫細胞支架會導致肝功能標志物上調，一些轉錄因子和核因子的表達水平與成人PHH相當[15]。另一種方法是使用PSC衍生的類器官[16]。對于類器官移植而言，如何在冷凍保存后，仍然能制備可擴增的、重復性高且穩定的類器官模型是最后的挑戰。最近的一項研究報道稱，hESC來源的類器官可以擴增20代，并且能穩定地保持雙潛能前體細胞的表型特征[17]。在小鼠體內移植后，它們可以分化為有功能的肝細胞或膽管上皮細胞，并展現出顯著的再殖能力。

此外，研究者把hiPSCs來源的細胞組成的肝芽異位移植到免疫缺陷的小鼠身上，發現肝芽可以快速地與小鼠的血管連接并且在10 d之后開始正常運作，移植到小鼠體內的肝芽在代謝方面與成人肝臟具有相似性。將肝芽移植到ALF小鼠模型中發現，與對照組相比，ALF小鼠存活率提高，表明移植到體內的肝芽具有肝臟自我修復能力，可作為橋梁發揮治療作用[9]。

五、hPSC來源的類器官在臨床治療應用中的限制

(一)實用操作問題 分化細胞的自體移植不僅需要將患者的細胞重編程為hiPSCs，還需要在患者患有單基因疾病的情況下，校正其基因以及促進其向肝細胞分化。這些過程可能需要3～4個月的時間，因此這種方法只適用于中度或較輕的病例。此外，還應該考慮到hiPSC-HLCs高昂的生產成本。隨著人類白細胞抗原(HLA)特征化凍存細胞庫以及即用型細胞治療產品的發展，同種異體移植的優勢逐漸顯現出來，因此，應開發有效的低溫保存方法來維持冷凍前肝細胞功能。目前很難大規模生產類器官，因為它需要PSCs的大規模培養，將類器官生產標準化和自動化(至少部分自動化)十分必要。

最后還需要確定肝細胞移植的途徑。門靜脈內注射可以將大量細胞輸送到肝竇，在無肝纖維化的患者中耐受性良好，然而這一方法可能導致門靜脈壓力升高，增加門靜脈血栓形成的風險。還有一種方法是使用海藻酸鹽水凝珠包裹肝細胞來進行移植，可以保護肝細胞不受患者免疫反應的排斥，這種方法在臨床前研究中產生了很好的療效。

(二)PSC-HLCs的安全問題 已建立GMP級別PSC株，可分化為肝細胞，并且具有高度可復制的表型和功能。對于最終產品質量的控制，不僅要考慮其功能，還要保證其安全性。hPSC-HLCs具有潛在的遺傳不穩定性,雖然不是所有的突變均會產生不良影響或形成腫瘤，但使用hPSC-HLCs必須保證PSCs基因組完整性。目前，細胞在分化為hiPSC-HLCs過程中基因組完整性的保存缺乏文獻記載，而且尚未建立分化方案和其遺傳完整性之間的聯系，這方面還需要進一步研究。此外還需考慮到最終治療產品中殘留的hPSCs在小鼠體內形成腫瘤的可能性。

許多研究小組對hPSC-HLCs的免疫原性進行了研究，一部分表明免疫系統對它們有很好的耐受性[18],另一部分根據所使用的細胞系不同而顯示出不同的免疫反應[19]。

(三)hPSC-HLCs在臨床應用中的倫理問題 由于hPSC-HLCs的來源和對hESCs的潛在應用，該技術在細胞治療中的使用涉及到倫理問題。細胞治療、基因治療和組織工程都需要隨著生物醫學或再生醫學領域技術的進步以及PSC研究等新領域的出現而迅速修訂相關法規。

綜上，由于PHHs來源有限以及在體外肝功能會迅速喪失，現已建立了一系列培養系統促進hPSC向肝細胞分化，并且在體外長期維持肝細胞功能。該系統可以作為藥物篩選和毒性分析的一種理想模型。目前已將臨床級別的PSC-HLCs用于臨床治療研究，但該技術的發展還需細胞生物學、臨床護理、生物工程和生物相容性材料科學等多學科跨學科的合作，才能在未來實現更好的應用前景。