抗CD200 抗體對膿毒癥小鼠肝臟保護作用及其機制的研究

曹利軍，蘇紅專，孫璐，王宜娜，李洪英，劉登輝

膿毒癥仍然是重癥監護病房中的主要挑戰，它以全身性炎癥反應和多器官功能衰竭為特征[1]。肝臟被認為是膿毒癥影響的第二大器官，在膿毒癥的患者中，往往會出現肝功能的異常；但是，膿毒癥引起的肝損傷一直被重癥監護室的醫師所忽視[2-3]。CD-200（cluster of differentiation 200）亦稱OX-2，是新型免疫球蛋白超家族1 型跨膜糖蛋白，能夠與CD200R1-4 結合。有研究證實，CD200/CD200R 信號通路在T 細胞反應的形成及維持中發揮著重要的負性調控作用，且參與T 細胞的分化和存活調控[4-5]。肝臟在多種疾病的免疫耐受中起了重要的作用，但使用CD200 阻斷劑后，對于膿毒癥相關性的肝損傷是否有保護作用及其可能的作用機制還不清楚。本研究旨在通過構建膿毒癥肝損傷的模型，觀察CD200 在小鼠肝臟組織的表達情況；探索抗CD200抗體對膿毒癥小鼠肝損傷是否存在保護作用，并初步闡明其可能的作用機制。現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 動物選取 C57BL/6 雄性小鼠（動物許可證號：SYXK（滬）2017-0004），年齡8 ～10 周，體質量22 ～30 g，購自海軍軍醫大學實驗動物中心。

1.1.2 主要儀器 L500 臺式低速自動平衡離心機（湖南湘儀實驗室儀器有限公司），OLYMPUSAU640全自動生化分析儀（日本OLYMPUS），電泳槽、轉膜槽（Biorad 公司）。

1.1.3 主要試劑 anti-CD200 抗體（ab254193，Abcam 公司）；Isotype 抗體（重組抗小鼠IgG 抗體，ab190475）；ELISA試劑盒（ebioscience公司），RT-PCR試劑（TakaRa公司），p65 抗體（8242，CST公司）、phospho-p65 抗體（3031，CST 公司）、IB抗體（9242，CST公司）、phospho-IB抗體（9246，CST 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 膿毒癥肝損傷模型構建 采用七氟烷麻醉小鼠，選取腹部正中切口，腹部皮膚常規消毒，切開腹部中線1 ～2 cm，暴露盲腸，用絲線在回盲瓣下結扎，用22 號針頭穿刺盲腸兩次，以誘發腹膜炎，將穿孔的盲腸回納腹腔，縫合切口，再次消毒皮膚，用無菌紗布包扎腹部。假手術組（Sham）進行相同的程序，但不結扎和穿刺盲腸。手術后，給予小鼠1 ml 0.9%氯化鈉注射液進行液體復蘇。所有的小鼠在手術前后都不限制食物和水。

1.2.2 動物分組及處理方法（1）將16 只C57BL/6雄性小鼠分為Sham 組、膿毒癥組（CLP 組），每組8只；手術后24 h 處死小鼠，取肝臟組織，加入2 ml 的PBS 緩沖液研磨，制作勻漿液，利用引物設計軟件Primer5 設計CD200 引物：上游：5’-TACCAGACTGCCCATCCTTG-3’，下 游：5’-TTGGTCGTCTCTTCCTCCAC-3’，上海捷瑞生物工程有限公司合成引物，采用RT-PCR法檢測各組小鼠肝臟組織CD200 mRNA 的表達水平。（2）將32 只C57BL/6 雄性小鼠分為Sham 組，膿毒癥組（CLP 組）、CLP +同型對照抗體治療組（Isotype組）、CLP+抗CD200 抗體治療組（anti-CD200 組），每組8 只。各組均在手術后24 h處死小鼠。anti-CD200 組小鼠在手術后1h，通過腹腔注射anti-CD200 抗體30g/只，容積為100l；Isotype組在手術后1h通過腹腔注射同型對照抗體（重組抗小鼠IgG 抗體）30g/只，容積為100l。

1.2.3 檢測外周血天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT） 心臟穿刺取血，全自動生化儀檢測外周血AST、ALT 水平。

1.2.4 肝臟組織病理 取肝臟組織，使用HE 染色，鏡檢觀察各組小鼠肝臟組織的壞死程度，病理讀片評分標準：0 分：無壞死；1 分：個別細胞壞死；2 分：小于30%的壞死；3 分：30 ～60%壞死；4 分：大于60%的壞死[6]。

1.2.5 腹腔沖洗液細菌計數 充分暴露各組小鼠腹腔，用2 ml PBS 液反復沖洗腹腔，吸取全部腹腔沖洗液，倍比稀釋至適宜濃度，涂抹于瓊脂糖凝膠平板上，37℃恒溫箱培養24 h 后，再進行菌落計數。

1.2.6 檢測外周血及肝臟組織中細胞因子的表達水平 心臟穿刺取血，ELISA 法檢測各組小鼠外周血中腫瘤壞死因子-（TNF-）、白介素-6（IL-6）水平變化；取肝臟組織，制作勻漿液，利用引物設計軟件Primer5設計各細胞因子的引物，TNF-：上游：5’-GGGCTACAGGCTTGTCACTCG-3’，下游：5’-ACTCCAGGCGGTGCCTATGTC-3’；IL-6：上游：5’-AGTTGCCTTCTTGGGACTGA-3’，下 游：5’-TCCACGATTTCCCAGAGAAC-3’，上海捷瑞生物工程有限公司合成引物，采用RT-PCR 法檢測各組小鼠肝臟組織TNF-、IL-6 mRNA 的表達水平。

1.2.7 Western-blot法檢測各組小鼠肝臟組織NF-B磷酸化水平 取肝臟組織，勻漿，離心后，以牛血清白蛋白為標準液，通過BCA 蛋白測定試劑盒（美國Thermo，USA）測定蛋白質水平。在非特異性結合位點封閉后，將膜與各種IB、phospho-IB、p65、phospho-p65 抗體在室溫下放置2 h。IB是組成核轉錄因子-B（NF-B）的一個蛋白基團，當檢測NF-B表達時，檢測IB是一個很有效的手段。通過ECL檢測系統證明蛋白條帶。通過光密度分析評估信號并進行標準化。

1.3 統計方法 采用Gradphad Prism 5.0 以及SPSS 18.0 軟件分析所有數據。計量資料采用均數±標準差表示，多組比較采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD- 檢驗；兩組比較用 檢驗。＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD200 在膿毒癥小鼠肝臟組織的表達情況Sham 組肝臟組織CD200 的表達為3.64±0.82，CLP組為7.19±1.17，CLP 組肝臟組織CD200 表達高于Sham 組（=7.053＜0.05）。

2.2 抗CD200 抗體對膿毒癥小鼠外周血AST、ALT的影響 anti-CD200 組AST、ALT 水平均明顯低于CLP 組（均＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠外周血ALT、AST 水平比較（ =8） U/L

2.3 抗CD200 抗體對膿毒癥小鼠肝臟病理的影響CLP 組肝臟組織表現為較嚴重的肝損傷圖像，可見大面積細胞變性，結構紊亂，細胞腫脹。anti-CD200組也存在肝損傷表現，但較CLP 組明顯減輕，未見大面積的肝細胞壞死。病理評分顯示，anti-CD200組 病 理 評 分（[1.82±0.45）分] 低 于 CLP 組（[3.23±0.84）分]，差異有統計學意義（=18.91，＜0.05）。見封二彩圖1。

圖1 抗CD200 抗體對膿毒癥小鼠肝臟病理的影響

2.4 抗CD200 抗體對膿毒癥小鼠腹腔沖洗液細菌負荷的影響 anti-CD200 組腹腔中細菌菌落數明顯低于CLP 組（均＜0.05）。見表2。

表2 各組小鼠腹腔沖洗液細菌負荷的比較（ =8）

2.5 抗CD200 抗體對膿毒癥小鼠外周血及肝臟組織細胞因子的影響 anti-CD200 組小鼠外周血及肝臟組織的TNF-、IL-6 水平均明顯低于CLP組（均＜0.05）。見表3 ～4。

表3 各組小鼠外周血TNF- 、IL-6 水平比較（ =8）pg/ml

表4 各組小鼠肝臟組織TNF- 、IL-6 mRNA 表達水平比較 pg/ml

3 討論

膿毒癥是感染引起的全身炎癥反應，也是多器官功能障礙綜合征的重要原因[7]。CD200 可表達于各種免疫細胞，CD200 及其受體相互作用參與機體的免疫調節[8]。本研究發現，與Sham 組相比，CLP組小鼠肝臟組織CD200 的表達明顯上調，這暗示CD200 及其受體可能參與了膿毒癥小鼠肝損傷的病程發展免疫調節過程。

在第二部分實驗中，筆者使用了CD200 阻斷劑，來驗證前面的推論。在臨床工作中，一般是采用監測ALT、AST 水平來評估肝臟的損傷程度。本實驗結果表明應用抗CD200 抗體后，其外周血ALT、AST水平明顯降低。本文病理結果顯示anti-CD200 組小鼠肝損傷的程度較CLP 組輕。另外，筆者比較了各組小鼠腹腔灌洗液細菌菌落的計數，結果顯示應用抗CD200 抗體后，CLP 組的腹腔灌洗液的細菌菌落數有明顯降低。這些結果不僅進一步說明CD200 及其受體的通路參與了膿毒癥引起的肝損傷的疾病進展過程，還暗示抗CD200 抗體能夠對膿毒癥引起的肝損傷起到保護作用。

發生膿毒癥時，機體產生大量的炎性因子，這些炎性因子與膿毒癥引起器官和組織的損傷密切相關[9]。膿毒癥引起的全身炎癥反應可促使TNF-、IL-6 大量釋放，研究證實TNF-是炎性反應過程中最早、最關鍵的炎性細胞因子，它在膿毒癥引起的肝損傷中起重要作用[10]。已有研究報道血中IL-6 水平的高低與膿毒癥的預后有密切關系[11]。本研究結果表明：CLP 組小鼠在接受抗CD200 抗體干預后，TNF-、IL-6 水平明顯降低，抗CD200 抗體保護了膿毒癥小鼠免受由于膿毒癥引起的大量的細胞因子釋放而導致的臟器損傷及繼發的免疫抑制狀態。

綜上所述，膿毒血癥小鼠肝臟的CD200 的表達水平明顯升高；抗CD200 抗體對膿毒血癥小鼠的肝損傷有保護作用，其保護作用可能通過抑制NF-B信號通路的活化，從而減少炎性細胞因子的釋放。當然，本研究存在一定的局限性，如研究觀察的時間點單一，未對膿毒血癥肝損傷進行24 h 動態觀察；只觀察了NF-B 一個信號通路且未對信號通路的下游機制進行探討。另外，本實驗只選了一個抗CD200 抗體劑量進行研究，在下一步的工作中，還需探討不同劑量的抗CD200 抗體在膿毒血癥模型中的作用。

圖1 抗CD200 抗體對膿毒血癥小鼠肝臟組織NF- B 磷酸化水平的影響