腫瘤細胞TRAIL 耐藥性的產生及緩解策略的研究進展

徐揚凱，任雨，樊曉驍

作者單位： 315000 寧波，寧波市泌尿腎病醫院

腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL）作為腫瘤壞死因子（TNF）超家族的一員，具有能夠特異性識別腫瘤細胞表達的促凋亡TRAIL 受體（TRAILR）的能力，進一步使其在誘導腫瘤細胞凋亡的同時對正常細胞不造成損傷。這一特性使得TRAIL 成為新型抗腫瘤藥物作用靶點的研究熱點，但同時部分腫瘤細胞極易產生針對TRAIL的耐藥性，使得其臨床應用進展緩慢。因而，對腫瘤細胞TRAIL耐藥性產生機制的研究及研究如何緩解這一耐藥性是TRAIL相關治療方案未來發揮其臨床價值的關鍵。

1 TRAIL 及其受體

TRAIL 作為TNF 超家族（TNFSF）的一員于1995 年被Wiley 等[1]發現，也被稱為TNF 超家族因子10（TNFSF10）和細胞凋亡配體2（Apo2L）。與TNF 和細胞凋亡配體1（Apo1L）等類似，作為TNFSF 一員的TRAIL 也同樣擁有造成腫瘤細胞凋亡的能力，并且在誘導凋亡的同時，TRAIL對正常組織影響極小，這一特點使得TRAIL介導的抗腫瘤治療受到廣泛關注[2]。

根據現有研究進展，已發現的TRAIL 受體共有5 種，依據能否誘導細胞凋亡可分為兩大類。一類是可使細胞凋亡誘導發生的TRAIL-R1 和TRAIL-R2，也分別被稱為死亡受體4（DR4）和死亡受體5（DR5），這兩者具有的共同特征即具有完整的死亡結構域（DD），使得這類受體與TRAIL 結合后可激活下游凋亡通路[3]。另一個受體類別包含TRAIL-R3、TRAILR4 和骨保護素（OPG）這三者，其中TRAIL-R3 和TRAIL-R4 也被稱為誘騙受體（DcR），依次稱為DcR1 和DcR2[4]。DcR1和DcR2 雖然也是膜受體，但在受體結構上與死亡受體差別較大，結構上的缺陷決定了這二者均無法激活凋亡通路。這一類受體與TRAIL結合不但無法發揮其促凋亡的生理功能，還會出現DcR與DR的競爭，進而導致DR 激活不充分，使誘導凋亡作用減弱[5]。而OPG 作為可溶性受體同樣沒有死亡結構域，其主要的生理功能為抑制破骨細胞的活動[6]。

2 TRAIL 誘導的凋亡信號通路

TRAIL 與DR4/DR5 結合后，使得死亡受體的胞內結構死亡結構域（DD）活化，而 Fas 相關死亡結構域蛋白（FADD）通過DD 實現了與DR 的結合，同時通過死亡效應結構域（DED）招募結合了同樣具有DED 結構的胱冬肽酶原-8（procaspase-8）和procaspase-10。至此，上述所有因子構成了一個統一的總體結構，被稱為TRAIL死亡受體復合物（DISC）[7]。無活性的procaspase-8 經過DISC 的激活和自活化成為有活性的胱冬肽酶-8（caspase-8）后，進入胞質中并進一步活化下游caspase-3，從而進一步導致細胞凋亡，這一通路過程被稱為外源性凋亡通路，基于這一通路的細胞被稱為I 型細胞。而在II 型細胞中，X 染色體連鎖凋亡抑制（XIAP）蛋白的高表達使得caspase-3 活性遭到抑制，這使得單純依靠外源性凋亡通路無法充分活化足夠的caspase-3 誘導凋亡[8]。為了克服XIAP 對caspase-3 的抑制，一部分caspase-8 的生理功能轉化為裂解活化BH3相互作用域死亡激動劑（BID），使其成為有活性的截短型BID（tBID），之后tBID 進入線粒體中進一步激活下游的BCL-2 關聯蛋白X（BAX）與BCL-2 拮抗蛋白（BAK），這兩者導致線粒體外膜通透性增強（MOMP）[9]。MOMP 觸發下游機制，使得線粒體釋放出第二線粒體衍生胱天蛋白酶激活劑（SMAC），SMAC 是XIAP 的一種自然抗體，可以消除XIAP 對caspase-3 活性的抑制[10]。同時，MOMP 也使得細胞色素c（cytochrome c）從線粒體中被釋放出來，而后細胞色素c 與凋亡蛋白酶激活因子1（APAF1）和procaspase-9 一道共同構成了凋亡體（Apoptosome），并進而產生了caspase-9，caspase-9 能增強caspase-3 的活化程度，從而加強凋亡誘導[9]。上述需要線粒體介導的凋亡誘導通路即被稱為內源性凋亡通路。

3 腫瘤細胞TRAIL耐藥性的產生機制

通過對TRAIL 介導的細胞凋亡通路的研究發現，有效TRAIL 含量、TRAIL 受體情況以及信號通路相關蛋白表達情況均是影響TRAIL介導的細胞凋亡的關鍵點。從理論上講，上述任意一方面出現異常，都是造成腫瘤細胞TRAIL耐藥的可能因素。

3.1 TRAIL 活性對耐藥性的影響TRAIL在人體中以同三聚體的形式發揮作用，但單純的三聚體形態穩定性不足，容易被清除失活，導致誘導信號強度不足以發揮其促凋亡作用，繼而產生TAIL耐藥性[11]。TRAIL 耐藥性的產生也與TRAIL 靶向性不足有關，難以在腫瘤局部形成充分效價，同時為達到有效治療濃度需提高TRAIL的使用量，同時造成對肝腎器官的影響[12]。

3.2 TRAIL 受體對耐藥性的影響TRAIL只有與DR結合后才能介導后續凋亡通路，已有研究表明，若腫瘤細胞DR表達不足，或DcR 表達過量，則導致即使在TRAIL充足的情況下仍無法充分介導凋亡通路誘導細胞凋亡，進而使腫瘤對TRAIL 的治療出現耐藥性[13]。同時研究表明部分腫瘤細胞存在網格蛋白依賴的胞吞作用（CME）及其介導的DR 胞吞現象，使得DR 盡管在mRNA 層面表達正常，但細胞表面的死亡受體仍偏少，導致細胞出現TRAIL 耐藥性[14]。另有研究表明，細胞表面的死亡受體需要如糖基化（glycosylation）等進一步修飾才能實現富集及構建DISC的功能，若修飾不足，如相關酶缺乏，也會出現耐藥性上升現象[15]。

3.3 信號通路因子對耐藥性的影響在凋亡信號通路傳導過程中，若促凋亡因子作用相對減少，或抗凋亡因子作用相對增強均有可能導致腫瘤細胞對TRAIL 的耐藥性。例如BCL-2 家族中同時存在促凋亡因子BID、BAX 和BAK，以及抗凋亡因子BCL-2 和BCLB，這類抗凋亡因子通過抑制MOMP 的發生對細胞凋亡產生影響，已有研究表明兩種凋亡因子表達失衡是腫瘤細胞產生TRAIL 抵抗的可能因素[16]。細胞型FADD樣IL-1 轉化酶（FLICE）抑制蛋白（c-FLIP）具有與caspase-8 高度同源的DED，可與caspase-8 在FADD 的結合上產生競爭，使得procaspase-8 無法活化[17]。同時有研究表明凋亡抑制蛋白（IAP）家族內的細胞型IAP 蛋白1（cIAP1）和cIAP2 等因子與前述的XIAP相似，可通過對caspase 活化的抑制來影響細胞凋亡[18]。另有研究表明，由于細胞凋亡的復雜性，除了上述TRAIL誘導凋亡通路相關因子的異常可導致TRAIL 耐藥以外，還有其他凋亡通路因子如核因子- B（NF- B）[19]及Jun氨基末端激酶（JNK）[20]等均會對TRAIL耐藥的產生造成影響。因此，對凋亡通路的研究是明確TRAIL耐藥性產生的一大重點。

4 TRAIL 耐藥性的緩解策略

通過對TRAIL耐藥機制的研究，當前針對耐藥性的緩解策略可分為三大類：第一類是對TRAIL進行修飾，通過在TRAIL上修飾基團或載體提高TRAIL 的穩定性和靶向性；第二類是采用DR 的激動型抗體與DR結合，并激活凋亡通路；第三類是將TRAIL 與其他物質聯合使用來提高腫瘤細胞對TRAIL 治療的敏感性。

4.1 經修飾的TRAIL 已有學者通過修飾聚組氨酸（poly-histidine）和FLAG抗原表位（FLAG epitope）等基團增強TRAIL 三聚體的穩定性；或添加具有靶向性的基團，如對應抗原的IgG抗體，獲得了較好的抗腫瘤效果[21]。除上述修飾基團的策略以外，將TRAIL與載體進行結合來提高穩定性和靶向性也是一大研究方向。De Miguel 等[22]通過將TRAIL修飾到脂質體納米微粒的表面，發現其能在淋巴瘤細胞表面誘導出足夠DR5的表達與聚集，進而強化了DISC的產生和凋亡的發生。也有研究人員使用金納米顆粒作為載體成功提高TRAIL敏感性，其機制可能為發動蛋白相關蛋白1（Drp1）表達增強，進而導致線粒體裂解[23]。部分學者考慮到免疫反應及納米微粒作為外來異物的抗原性，提出使用諸如人血白蛋白（HAS）等人體自身蛋白以及人體細胞作為載體來提高TRAIL 的穩定性和有效性的想法，拓展了TRAIL載體的研究方向[24-25]。

4.2 死亡受體的激動劑 除修飾TRAIL 思路外，也有研究者考慮構建高效穩定的激動劑直接活化DR 誘導凋亡。但目前研究表明，單純使用DR 激動劑效果提升并不明顯，如Ciuleanu 等[26]對肝細胞癌患者進行了基于一種DR4 受體激動劑（mapatumumab）的二期臨床試驗，發現并不能有效提升患者的無進展生存期。基于此，構建可激活多個受體的聯合激動劑是當前的進展方向，如Brünker 課題組構建了針對DR5 和成纖維細胞活化蛋白（FAP）的聯合激動抗體RG7386，在抗腫瘤效應方面較單抗體有了明顯的提升[27]。而Satta 等[28]構建了CD3-DR5 聯合抗體，在活化TRAIL 相關細胞凋亡的同時，活化T 細胞啟動細胞免疫，提高了腫瘤細胞的殺滅效果。

4.3 TRAIL 的聯合用藥 將TRAIL 與化學藥物、生物提取物等聯用也是當前破解TRAIL耐藥性的研究熱點，作用機制主要集中在對死亡受體的調節以及信號通路的影響。有學者將姜黃素與TRAIL 聯合應用后發現，與TRAIL 單用相比，二者聯用可顯著提高腫瘤細胞DR4與DR5 的表達，同時對c-FLIP、MCL-1及XIAP 等抗凋亡因子產生抑制作用，進而提高了TRAIL 的凋亡誘導效果[29]。中藥木蘭屬提取物和厚樸酚（Honokiol）同樣被發現具有增強TRAIL 敏感性的功能，其作用機制經研究表明主要是對抗凋亡蛋白c-FLIP和生存素等的抑制，使TRAIL誘導的凋亡增強[30]。紫草科提取物乙酰紫草素（Acetylshikonin）也被證實可通過ROS家族活化p53/PUMA/BAX通路后增強肝細胞癌對TRAIL 治療的敏感性[31]。上述研究表明對中醫藥的進一步研究可有助于新型抗腫瘤療法的發現。

在化學藥物方面，Uddin等[32]發現一種蛋白磷酸酶2A（PP2A）抑制劑LB-100可有效抑制三陰乳腺癌細胞對TRAIL的耐藥性，PP2A被證明通過影響蛋白激酶B（PKB）使腫瘤細胞產生TRAIL 耐藥性。硼替佐米作為多發性骨髓瘤治療的一線藥物，基于人胃癌細胞株的實驗表明，其通過活化細胞外調節蛋白激酶（ERK1/2）提高細胞表面DR5 的表達，其增強了TRAIL 誘導凋亡的效果[33]。甲狀腺未分化癌雖然罕見，但患者預后極差，而維莫非尼與TRAIL 的聯用方案在細胞和動物模型上均取得了良好的抑瘤效果，顯著提高了TRAIL治療的敏感性[34]。

5 結語

TRAIL因其具有針對腫瘤細胞的特異性殺傷能力而受到廣泛研究，但自身結構的不穩定性及個別腫瘤易對其產生耐藥性，TRAIL 相關治療手段的臨床應用仍很困難。隨著對TRAIL 致凋亡機制及耐藥機制的深入研究，如何緩解TRAIL 耐藥性的方法越來越多樣，從構建重組TRAIL 聚合體到開發死亡受體激動劑，再到構建TRAIL聯合用藥體系都各有亮點。雖然目前來看單一緩解策略仍無法全面解決TRAIL 治療存在的不足，對TRAIL耐藥機制的產生由于腫瘤細胞的差異仍有許多未知區域等待進一步探索，但當前多個研究道路的開辟仍為將來把TRAIL 相關治療方案應用于臨床實踐提供了理論依據。如果未來隨著后續研究的進一步深入，TRAIL 相關治療最終能應用于臨床，這將為腫瘤的治療提供重要手段。