甲鈷胺對牙髓干細胞體外成神經向分化的影響

吳作棟，潘爽，李艷萍，何麗娜，張維甲，牛玉梅

(哈爾濱醫科大學附屬第一醫院牙體牙髓病科，哈爾濱 150001)

面神經損傷是口腔科常見疾病之一，可由外傷、腫瘤、炎癥以及醫源性損傷引起，會導致患者出現語言障礙、進食困難、無法傳達面部表情等，嚴重影響患者身心健康。目前神經損傷的治療仍是臨床上的挑戰之一，近年來應用干細胞治療神經損傷成為研究熱點。干細胞能夠增強運動神經元的再生能力，并且干細胞可以分化為神經元樣細胞以代替受損的神經元，恢復神經支配以避免肌肉的早期萎縮[1-2]。牙髓干細胞和神經細胞均起源于神經嵴細胞，有較強的神經分化潛能，可分化為功能性神經元以及神經膠質細胞，還能分泌和表達多種神經營養因子。牙髓干細胞可通過拔除的阻生第三磨牙獲取，是較為理想的替代受損神經細胞的來源[3-4]。甲鈷胺是內源性維生素B12，在維生素B12中心的鈷分子上結合了1個甲基，其活性更高，可促進核酸、蛋白和脂肪的代謝。甲鈷胺是甲硫氨酸合成酶的輔酶，在高半胱氨酸向甲硫氨酸轉化過程中起重要作用。神經組織發生損傷時，甲鈷胺可以促進損傷區域施萬細胞的分裂以及髓鞘的再生，從而促進受損神經恢復，是臨床上治療神經系統病變的常用藥物[5]。研究表明，甲鈷胺能夠誘導大鼠的骨髓間充質干細胞分化為神經元樣細胞[6]，而甲鈷胺對牙髓干細胞成神經向分化的影響鮮有報道。本研究主要分析甲鈷胺對牙髓干細胞成神經向分化的作用，以期為臨床上應用甲鈷胺及牙髓干細胞治療面神經損傷提供理論參考。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器 甲鈷胺(上海阿拉丁生化科技股份有限公司生產，批號：20191203)，0.25%胰酶/乙二胺四乙酸二鉀、青霉素/鏈霉素、胎牛血清(美國Gibco公司)，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)、DMEM高糖培養基(美國Hyclone公司)，四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium assay,MTT)(美國Sigma公司)，巢蛋白(Nestin)、神經絲H(nerve filament H，NF-H)、S100一抗(武漢博士德生物工程有限公司)，倒置熒光顯微鏡IX73(日本Olympus公司)，酶標儀ELX800(美國BioTek公司)等。

1.2兔牙髓干細胞的分離和培養 清潔級健康新西蘭家兔8只，雄性，體重2.0～2.5 kg，購自哈爾濱珍寶藥業有限公司，許可證號：SCXK(黑)2018-0001，實驗于哈爾濱醫科大學附屬第一醫院動物實驗中心進行(實驗動物及方案通過哈爾濱醫科大學附屬第一醫院動物倫理委員會批準)，飼養條件：室溫20～25 ℃,濕度55%～65%。完整拔除兔牙，無菌環境中取出牙髓組織，采用酶解組織塊法分離和培養兔牙髓干細胞[7]。

1.3MTT法測定 MTT法檢測不同濃度甲鈷胺對兔牙髓干細胞活性的影響，將第四代兔牙髓干細胞以3×103個/孔的密度接種于96孔板中，放入孵箱24 h，待細胞貼壁后，去除培養基。將細胞按照不同的處理方式分為對照組和實驗組，對照組加入含10% FBS、1%雙抗的DMEM高糖培養基，實驗組分別加入含有25、50和100 mg/L甲鈷胺的DMEM高糖培養基，分別于第1、2和3天時加入MTT溶液(0.5 mg/mL)，放入孵箱4 h后小心吸取培養基，加入二甲基亞砜15 min后在490 nm處測量吸光度值，每組設置3個平行對照。

1.4牙髓干細胞的神經誘導及分組 配制神經誘導液進行神經誘導[8]，A液是包含10 ng/mL堿性纖維母細胞生長因子、500 μmol/L β-巰基乙醇和10% FBS的DMEM/F12培養基；B液是含有100 μmol/L丁基羥基茴香醚和2%二甲基亞砜的無FBS的DMEM高糖培養基。按照不同的處理方式分為4組，對照組：兔牙髓干細胞在DMEM高糖培養基中培養72 h；甲鈷胺組：兔牙髓干細胞在含有100 mg/L甲鈷胺的DMEM高糖培養基中培養72 h；神經誘導液組：兔牙髓干細胞在DMEM高糖培養基中培養42 h，然后依次在A液、B液中培養24 h和6 h；甲鈷胺+神經誘導液組：兔牙髓干細胞在含有100 mg/L甲鈷胺的DMEM高糖培養基中培養42 h，然后依次在A液和B液中培養24 h和6 h，每組設置3個平行對照。

1.5蛋白免疫印跡 采用蛋白免疫印跡法檢測神經誘導后兔牙髓干細胞NF-H和S100蛋白的表達情況。以3×105個/孔的密度將第四代兔牙髓干細胞接種于6孔板中，24 h細胞貼壁后進行神經誘導實驗。神經誘導實驗后用含有苯甲基磺酰氟的組織快速裂解液(苯甲基磺酰氟∶組織快速裂解液=100∶1)提取細胞總蛋白，二喹啉甲酸法測定蛋白濃度。每孔總蛋白上樣量25 μg，8% Tris-甘氨酸十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后，濕轉法轉到聚偏二氟乙烯膜上，配制5%脫脂奶粉封閉液，室溫條件下封閉2 h。孵育、Nestin、NF-H和S100一抗4 ℃過夜，用含0.05% Tween-20的Tris-HCl緩沖鹽溶液漂洗3次，室溫條件下進行二抗孵育1 h，Tris-HCl緩沖鹽溶液漂洗3次，采用電化學發光液曝光顯影。用Image J軟件分析圖像的灰度值，以β-actin為內參，每組設置3個平行對照。

1.6免疫熒光 兔牙髓干細胞接種于24孔板中，每孔接種量為1×104個/mL。用含有100 mg/L甲鈷胺的DMEM高糖培養基培養3 d，對照組為不含甲鈷胺的DMEM高糖培養基培養3 d。PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次，0.1% Triton X-100透膜15 min，PBS漂洗3次，1%封閉液封閉20 min，孵育NF-H和S100一抗4 ℃過夜，PBS漂洗一遍，避光下孵育熒光二抗1 h，PBS漂洗一遍后熒光顯微鏡下拍照，每組設置3個平行對照。

1.7茜素紅染色 兔牙髓干細胞接種于24孔板中，每孔接種量為1×104。用含有100 mg/L甲鈷胺的DMEM高糖培養基培養3 d，對照組為不含甲鈷胺的DMEM高糖培養基培養3 d。PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次，配置濃度為1%的茜素紅染色染液，然后加入1 mL室溫保持30 min，蒸餾水沖去表面染色，自然風干，顯微鏡下觀察，拍照，隨機選取5個視野統計礦化結節數量，實驗重復3次。

2 結 果

2.1細胞形態學觀察 采用酶解組織塊法分離和培養兔牙髓干細胞，原代細胞培養2 d時可見組織塊周圍有細胞游出，細胞貼壁，呈紡錘形和梭形(圖1a)，培養7 d傳代，細胞呈單一長梭形(圖1b)。

1a：原代細胞形態；1b：傳代細胞形態

2.2甲鈷胺對兔牙髓干細胞活性的影響 MTT結果顯示，第1、2和3天時，各組間OD值比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 不同濃度甲鈷胺OD值的比較

2.3甲鈷胺誘導兔牙髓干細胞成神經向分化的濃度選擇 蛋白免疫印跡法結果顯示,不同濃度甲鈷胺處理兔牙髓干細胞3 d后Nestin蛋白的相對表達量比較差異有統計學意義(P<0.01)，25 mg/L、50 mg/L 和100 mg/L甲鈷胺組Nestin蛋白的相對表達量高于對照組，50 mg/L和100 mg/L甲鈷胺組高于25 mg/L甲鈷胺組，100 mg/L甲鈷胺組高于50 mg/L甲鈷胺組(P<0.05)，見圖2和表2。因此，選擇100 mg/L甲鈷胺用于后續實驗。

Nestin：巢蛋白;β-actin:β-肌動蛋白

表2 不同濃度甲鈷胺處理兔牙髓干細胞3 d后Nestin蛋白的相對表達量比較

2.4甲鈷胺對兔牙髓干細胞成神經向分化的影響 蛋白免疫印跡法結果顯示，各組細胞的NF-H和S100蛋白相對表達量比較差異有統計學意義(P<0.01)，100 mg/L甲鈷胺組、神經誘導液組、100 mg/L甲鈷胺+神經誘導液組NF-H和S100蛋白相對表達量高于對照組，神經誘導液組、100 mg/L甲鈷胺+神經誘導液組高于100 mg/L甲鈷胺組，100 mg/L甲鈷胺+神經誘導液組高于神經誘導液組(P<0.05)，見圖3和表3。免疫熒光染色結果顯示，與對照組相比，經過100 mg/L甲鈷胺處理3 d后，兔牙髓干細胞的NF-H和S100明顯呈陽性表達，見圖4。

NF-H：神經絲H;β-actin:β-肌動蛋白

表3 各組細胞的NF-H和S100蛋白相對表達量比較

2.5甲鈷胺對兔牙髓干細胞礦化結節的影響 茜素紅染色結果顯示，經過100 mg/L甲鈷胺處理3 d后細胞排列呈以礦化結節為中心的火山口樣、漩渦狀，局部聚集成灶，礦化結節數為(2.41±0.14)個，對照組為(0.82±0.11)個，兩組比較差異有統計學意義(t=15.468，P<0.001)。見圖5。

3 討 論

面神經缺損的修復一直是口腔醫學界的難題之一，神經受損后患者的生活質量大大降低。自體神經移植仍是目前修復神經缺損的金標準，但該技術有一定的局限性，包括可移植的神經數量有限、造成供區額外損傷、形成神經瘤等[9]。

近年來，神經損傷的干細胞療法備受關注。牙髓干細胞是來源于神經嵴的間充質干細胞，其增殖能力強，具有多向分化潛能，在體外可被誘導分化為神經元樣細胞[10]。牙髓干細胞可以從阻生齒或正畸拔除的牙中提取出來，其不僅能表達多種神經標志物(Nestin、膠質纖維酸性蛋白抗體、S100等)，還能分泌多種神經營養因子[11]，是一種理想的促進神經損傷恢復的干細胞。甲鈷胺作為內源性維生素B12，對維持神經系統的穩定發揮著重要作用，人體缺乏甲鈷胺會引起神經系統病變[12]。甲鈷胺參與甲基化循環過程，為該循環中的某些甲基化反應提供甲基供體[13]。有研究表明，甲鈷胺可以促進大鼠小腦顆粒神經元神經突觸的生長[14]，大鼠骨髓間充質細胞經甲鈷胺誘導后會分化為神經元樣細胞[6]。甲鈷胺還能促進大鼠脫髓鞘坐骨神經中施萬細胞的分化和髓鞘的再生[15-16]。本研究采用酶解組織塊法分離和培養兔牙髓干細胞開展研究，MTT檢測結果顯示，經過含有不同濃度甲鈷胺的DMEM完全培養基培養后，第1、2和3天時各組OD值比較差異無統計學意義(P>0.05)，表明甲鈷胺對兔牙髓干細胞的活性無抑制作用，不會影響牙髓干細胞的增殖。

圖4a-4f為NF-H的染色；圖4g-4l為S100的染色；NF-H：神經絲H

圖5 用含和不含100 mg/L甲鈷胺的DMEM培養基培養兔牙髓干細胞3 d后兔牙髓干細胞礦化結節情況(茜素紅染色，×400)

Nestin主要在胚胎期的神經干細胞和神經前體細胞中表達，被廣泛用于神經干細胞鑒定，并被視為神經細胞再生的生物學標志物[17-18]。本實驗蛋白免疫印跡法結果顯示,不同濃度的甲鈷胺在3 d后均明顯促進兔牙髓干細胞Nestin蛋白的表達，證明甲鈷胺可促進兔牙髓干細胞的神經向分化，且100 mg/L甲鈷胺組表達量高于50 mg/L甲鈷胺組和25 mg/L甲鈷胺組。神經絲是細胞骨架的一種，其主要存在于神經元，能夠支持細胞，對細胞間的物質交換以及細胞的分化起重要作用。NF-H是高分子神經絲蛋白，其出現代表著神經元的成熟[19]。S100蛋白能夠調節細胞的能量代謝和鈣離子水平，具有營養神經的作用，能夠促進神經損傷的修復[20-21]。本實驗中蛋白免疫印跡法和免疫熒光實驗檢測NF-H和S100蛋白相對量，結果顯示，經過甲鈷胺處理后，兔牙髓干細胞的NF-H和S100表達升高；免疫熒光實驗也顯示，經過甲鈷胺處理后，兔牙髓干細胞的NF-H和S100呈明顯的陽性表達，神經向分化的最終環節是細胞外基質礦化，經過100 mg/L甲鈷胺處理3 d后細胞排列呈以礦化結節為中心的火山口樣、漩渦狀，局部聚集成灶，均證明了甲鈷胺能夠促進兔牙髓干細胞的成神經向分化，但具體的調節機制還有待進一步實驗探究。

綜上所述，甲鈷胺處理3 d后能夠促進兔牙髓干細胞的成神經向分化，且不影響細胞的活性，進一步應用于動物實驗是可行的，該實驗可為未來臨床應用甲鈷胺及牙髓干細胞治療面神經損傷及其他神經系統病變提供理論參考。