血漿母系表達基因3和H19水平與妊娠期糖尿病胰島素抵抗的關系

宋曉東，朱學濤，朱立梅，李 偉

0 引 言

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指妊娠期間首次發生或發現的糖代謝異常，可能引起孕婦發生流產、圍生期酮癥酸中毒、產后出血等多種合并癥，對胎兒也構成極大威脅，可能造成胎兒窘迫、早產、畸形等，孕期行口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test，OGTT)篩查并及時進行干預，可改善妊娠結局。GDM機制復雜，一般認為與胰島素抵抗(insulin resistance，IR)有關，盡早發現IR，并采取相關措施進行控制，對于降低GDM發病風險有重要意義[1-2]。哺乳動物基因組中98%轉錄序列不具備蛋白質編碼功能，屬于非編碼RNA，其中長度在200個核苷酸以上的為長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)，母系表達基因3(maternally expressed gene 3，MEG3)、H19均屬于LncRNA。MEG3基因定位于人染色體14q32.3，具高度保守性，已有研究表明其在人胰島β細胞中為高表達，可促進胰島素分泌[3-4]。H19定位于人染色體11p15.5，包含5個外顯子，4個內含子，具父系印記特性，選擇性表達母源性等位基因，是最早被鑒定的印跡基因之一，已被報道與IR密切相關[5]。本研究通過探討血漿MEG3、H19水平與GDM患者IR的關系，以期為GDM的發病機制及臨床防治工作提供參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2016年1月至2019年1月孕24～28周在我院行OGTT并確診為GDM的孕婦65例為GDM組，年齡22～37歲。參照文獻[6]的診斷標準：將75 g葡萄糖溶于250～300 mL水中，受試者在5 min內口服完畢，分別采集服用后1 h、2 h靜脈血，檢測血糖水平，滿足以下任何一項即可診斷為GDM：空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)≥5.1 mmol/L，服糖1 h血糖≥10.0 mmol/L，服糖2 h血糖≥8.5 mmol/L。納入標準：①經OGTT確診為GDM；②首次、單胎妊娠。排除標準：①曾被診斷為糖尿病者；②多胎妊娠者；③有糖尿病家族史者；④肝、腎等重要器官功能障礙者；⑤臨床資料不完整者。另外選取同期80例孕周為24～28周正常妊娠孕婦為對照組，年齡23～38歲。本研究經醫院倫理委員會批準(批號：201511003)，所有受試者均自愿簽署知情同意書。

1.2 方法受試者均于清晨抽取5 mL空腹靜脈血。FPG水平采用日立7600型生化分析儀測定，糖化血紅蛋白(glycated hemoglobin，HbA1c)采用Arkray HA-8180型全自動分析儀(日本)檢測；采用放射免疫法檢測空腹胰島素(fasting insulin，FINS)水平，試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司；采用穩態評估模型評估胰島素抵抗指數(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)，HOMA-IR≥2.69即判為IR[7]。計算公式：

HOMA-IR=FPG(mmol/L)×FINS(mU/L)/22.5

采用qRT-PCR檢測血漿中MEG3、H19水平，儀器為Roche LightCycler 480Ⅱ型熒光定量PCR儀。采用Trizol法提取總RNA，反轉錄為cDNA，進行PCR擴增反應。以GAPDH為內參基因，MEG3正向引物：5′-ATCATCCGTCCACCTCCTTGTCTTC-3′，反向引物：5′-GTATGAGCATAGCAAAGGTCAGGGC-3′，反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環。H19正向引物：5′-ACAGGAGAGAGACTTCCA-3′，反向引物：5′-ATGTCCTGCTTGTCACGTCC-3′，反應條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環，引物及試劑盒均購于上海生工生物工程有限公司，操作嚴格按照說明書進行，采用2-ΔΔCt法計算MEG3、H19水平。

2 結 果

2.1 一般資料比較2組年齡、BMI比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。GDM組FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR均顯著高于對照組(P<0.01)。見表1。

表1 入組孕婦一般資料比較

2.2 血漿MEG3、H19水平比較GDM組血漿MEG3水平顯著低于對照組(P<0.01)，H19水平顯著高于對照組(P<0.01)，見表2。

表2 入組孕婦血漿MEG3、H19水平比較

2.3 GDM組血漿MEG3、H19水平與FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR相關性分析Spearman相關分析結果顯示，GDM組血漿MEG3水平與FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR均呈負相關(P<0.01)，血漿H19水平與FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR均呈正相關(P<0.01)，見表3。

表3 GDM組血漿MEG3、H19水平與FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR相關性分析

2.4 影響IR發生的多因素Logistic回歸分析以是否發生IR為因變量，以MEG3、H19水平為自變量進行多因素Logistic回歸分析，結果表明，MEG3是IR發生的保護因素(P<0.01)，H19是危險因素(P<0.01)，見表4。

表4 影響胰島素抵抗(IR)發生的多因素Logistic回歸分析結果

3 討 論

GDM是妊娠期常見糖代謝異常疾病，是日后患2型糖尿病的高危人群，隨著飲食結構變化、肥胖及高齡產婦的增加，近年發生率呈逐漸升高趨勢，我國發生率約為1%～5%[8]。GDM發病機制目前尚未闡明，研究發現發病原因可能是妊娠期雌激素、生乳素等由胎盤分泌的激素釋放進入母體循環使全身水平升高，增強了對胰島素的拮抗作用，隨孕周增加胰島素敏感性下降，胰島素分泌受限的孕婦則發展為GDM[9-11]。胰島β細胞合成分泌的胰島素是機體內唯一具有降低血糖功能的蛋白質類激素，在維持血糖水平上起決定性作用[4]。IR是指胰島素促進機體攝取及利用葡萄糖能力下降，正常妊娠女性隨著體內激素水平變化可表現出生理性、暫時性IR狀態，通常在孕周24～28周表現顯著，于34～36周達到峰值，在分娩后逐漸消失，GDM患者生理性、病理性IR并存[11-12]。本研究發現，與對照組比較，GDM組FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR均較高，提示GDM患者存在不同程度IR，與上述研究結果一致。

LncRNA可在轉錄及轉錄后水平調控基因表達，參與細胞信號傳導、細胞增殖分化、免疫應答等多種生理活動過程，與腫瘤、代謝性疾病等關系密切，正常生理狀態下，MEG3在機體組織中為高表達，在腫瘤組織中表達降低或缺失，發揮抑癌基因作用[13]。近年來LncRNA與IR的關系引起諸多研究者的興趣，LncRNA的作用發揮具組織特異性，同一種LncRNA在不同組織中對血糖可能發揮相反調節作用。研究發現，小鼠胰腺組織中MEG3與心、肝、脾等組織相比為高表達，具有組織特異性，抑制MEG3表達后，胰島素分泌量減少，胰島β細胞凋亡增加，與此同時，葡萄糖耐受能力受損，MEG3可能通過參與胰島素的合成及分泌，在維持成年小鼠胰島功能中發揮重要作用[3-4]。本研究發現，GDM組血漿MEG3水平顯著低于對照組，提示MEG3可能參與GDM患者IR的發生。分析原因是低水平的MEG3可能通過對胰十二指腸同源盒因子-1肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源物A基因表達產生抑制作用，進而使胰島素合成、分泌減少[14]。另有研究表明，MEG3與肝糖異生關系密切，MEG3可通過激活叉頭框蛋白1，增加葡萄糖6磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶表達，從而促進糖異生，減少糖原合成[5]。

H19在胚胎發育中呈現高表達并在出生后顯著下降，僅在成年人骨骼肌及心肌中觀察到持續表達，在腫瘤等細胞大量分化疾病中呈現高表達[15]。H19在不同的腫瘤中表達情況各異，在胃癌、宮頸癌、胰腺癌等腫瘤中呈現高表達，發揮促癌基因作用，在前列腺癌、肝癌等腫瘤中呈現低表達，發揮抑癌基因特性，H19在不同腫瘤中可能發揮不同作用，甚至在同一腫瘤中發揮促癌及抑癌基因的雙重作用[16]。H19與IR的研究越來越受到關注，研究表明，H19在高脂飲食小鼠肝臟中高表達，高水平的H19可促進肝臟產生葡萄糖，進而增加高血糖、IR發生風險，全身敲除H19可使胰島素抑制肝臟糖異生的作用增強，但也有研究表明，下調肝臟中H19表達，可使小鼠血糖水平升高，糖耐量受損，糖異生基因表達上調，上述結論提示H19在肝糖異生中發揮的作用目前尚不明確[5,17-18]。本研究發現，GDM組血漿H19水平顯著高于對照組，提示H19與IR關系密切。Spearman相關分析結果顯示，GDM組血漿MEG3、H19水平與FPG、HbA1c、FINS、HOMA-IR均具相關性，提示MEG3、H19可能用于評估GDM患者IR嚴重程度。多因素Logistic回歸分析結果顯示，MEG3是IR發生的保護因素，H19是危險因素，可能從危險因素方面防治IR，降低不良妊娠結局的發生。

綜上所述，GDM患者血漿MEG3呈低表達，H19為高表達，且與HOMA-IR具相關性，或可為GDM的靶向治療提供新思路，本研究也存在不足之處，樣本量較少，可能造成結果偏差，尚需大樣本研究對結果進行佐證，這將成為今后的工作重點。