中藥川貝母產地生態適宜性區劃與DNA分子鑒別研究進展

羅 舜，章文偉，羅 敏，鄧才富，鄒艷，楊永東，李品明

(重慶市藥物種植研究所，重慶 南川 408435)

中藥川貝母(FritillariaecirrhosaeBulbus)為百合科貝母屬多年生植物，分別是川貝母FritillariacirrhosaD. Don、暗紫貝母F.unibracteataHsiao et K. C. Hsia、甘肅貝母F.przewalskiiMaxim.、梭砂貝母F.delavayiFranch.、太白貝母F.taipaiensisP. Y. Li和瓦布貝母F.unibracteataHsiao et K. C. Hsia var.wabuensis(S. Y. Tang et S. C. Yue) Z. D. Liu,S. Wang et S. C. Chen六種[1]。中藥川貝母為鱗莖入藥，主用于痰熱咳嗽、咯痰帶血、瘰疬瘡瘍腫毒[2]。現代藥理研究表明其具有鎮咳祛痰、平喘、抗癌、抗菌消炎等作用[3]。中藥川貝母因其需求量大、生境特殊且種子休眠期長、自然萌發率低、野生資源過度采挖等原因被收載到《國家重點保護野生藥材物種名錄》中[4-5]。一些地區引種馴化中藥川貝母成功率不高，原因在于引種品種與當地生態環境不適宜[6]。因此，開展中藥川貝母產地生態適宜性研究來增加藥材資源供給就顯得十分迫切[7-8]。中藥材的基原決定臨床用藥的真偽[9]，市場上流通的不合格的中藥川貝母中往往摻雜有浙貝母、平貝母、伊貝母、湖北貝母等偽品[10-11]。對不同來源的種植材料、中藥材進行鑒定分析就顯得十分重要，而分子鑒別技術具有不受外界環境差異和生物體發育階段及器官組織差異等影響的優點[12]。本文從中藥川貝母6種基原植物的傳統產區情況、基于地理信息系統(GIS)對其進行產地生態適宜性區劃及其DNA分子鑒別技術(PCR-RFLP、DNA條形碼技術、實時熒光定量PCR)等方面給以綜述，為保證中藥川貝母的不同基原品種在生態適宜的區域種植出質優的中藥材研究提供參考。

1 中藥川貝母的傳統產區情況

表1 中藥川貝母6種基原植物在全國范圍內傳統的產區情況Table1 Traditional production areas of six basic plants of F. cirrhosae Bulbus in China

2 中藥川貝母產地生態適宜性區劃分析技術

2.1 中藥材產地適宜性分析地理信息系統及其升

級系統

中國醫學科學院藥用植物研究所以GIS為分析平臺，評價藥材道地產區氣候、土壤和海拔等生態地理因子與全國其他地區的相似性差異，根據相似程度等級來確定藥材的適宜產地，為藥材引種成功開發了《中藥材產地適宜性分析地理信息系統》(Traditional Chinese medicine geographic information system，TCMGIS-I)[17-18]。王瑀等人[19]應用該系統分析了中藥川貝母基原植物之一的暗紫貝母在全國的產地適宜性區劃，得到一部分與若爾蓋生態氣候條件相似的可以發展暗紫貝母生產的新的可能區域。劉輝等人[8]將該系統應用于川貝母的產地適宜性研究，也得到一些未見文獻報道的川貝母適宜產區，比如新疆的拜城縣、烏魯木齊市等11個縣市。段寶忠等人[20]采用升級系統《中藥材產地適宜性分析地理信息系統》(TCMGIS-Ⅱ)分析了太白貝母在全國的產地適宜性區劃。結果表明，全國適宜主產區面積大小按省份排名依次為四川、甘肅、陜西，居第四位的云南省為新的適宜區域。張婕等人[21]采用更新為全球的4大數據庫(基礎地理信息數據庫、氣候因子數據庫、土壤數據庫和藥用植物分布空間數據庫)后的藥用植物全球產地生態適宜性分析信息系統(Geographic information system for global medicinal plants，GMPGIS)[22]研究了中藥川貝母6種基原植物川貝母、暗紫貝母、甘肅貝母、梭砂貝母、太白貝母和瓦布貝母在全球的生態適宜性區劃。結果表明，中國和美國所占區域超過全球最適栽培區面積的2/3以上，中國為57%，美國為29%，哈薩克斯坦、吉爾吉斯斯坦等我國相鄰國家亦有少量最適栽培區域。

2.2 遙感技術

方清茂等人[23]在GIS軟件的支持下，從川產道地藥材生長生態因子空間數據中提取適宜暗紫貝母生長要求的高程、年平均氣溫和年降水量，然后將獲得的高程、年均溫和年降水3圖層依次疊加到通過分析遙感影像得到的四川省土地利用現狀圖中，最后進行空間分析。結果顯示，暗紫貝母的最適宜區主要為四川青藏高原東南緣的亞寒帶干燥氣候區，如阿壩藏族自治州若爾蓋、紅原、松潘、九寨溝、茂縣、黑水、理縣、馬爾康等地。

2.3 最大墑情模型(Maxent模型)

Maxent模型應用在物種分布數據不全的情況下，可以得到關于物種潛在分布區的滿意結果[24]。劉艷梅等人[25]首先用Maxent模型選取對暗紫貝母的分布貢獻率較大的主要生態因子，然后將Maxent生成的數據導入GIS系統中，得出暗紫貝母在全國的潛在分布適生區，結果表明四川阿壩藏族羌族自治州、青海省果洛藏族自治州和甘肅省甘南藏族自治州是暗紫貝母最適宜的潛在種植區。王娟娟等人[26]采用GIS結合Maxent模型的方法，對川貝母進行了產地生態適宜性區劃，結果得出川貝母在我國的最適宜區面積由大到小依次是四川、西藏、云南、甘肅和貴州等地。趙文龍等人[6]對中藥川貝母的4個基原植物川貝母、甘肅貝母、梭砂貝母和暗紫貝母的適宜區也按同樣的方法進行了研究。結果表明，川貝母最適宜區主要分布在四川中西部、云南北部及西藏東部；甘肅貝母最適宜區主要分布在甘肅甘南地區與青海交界處、四川西部地區；梭砂貝母最適宜區主要集中在川藏交界處的大部分山區；暗紫貝母最適宜區主要集中在甘肅甘南、四川阿壩和青海果洛的部分地區。蔣舜媛等人[4]按相同的方法對中藥川貝母的5個基原植物太白貝母、梭砂貝母、甘肅貝母、川貝母、暗紫貝母進行了適宜性區劃，得到中藥川貝母的生長適宜性空間分布數據之后，還將其和與中藥川貝母化學指標成分總生物堿相關的品質適宜性空間分布數據相關聯，最后再結合土地利用等環境因素進行綜合分析，形成了對實際生產有指導意義的中藥川貝母功能型生產區劃。研究結果表明，中藥川貝母功能型生產區劃主要分布在四川、甘肅、青海、西藏、云南和陜西這6個省的適宜性區縣。

3 中藥川貝母的DNA分子鑒別技術

3.1 聚合酶鏈式反應—限制性片段長度多態性

(PCR-RFLP)技術

PCR-RFLP是一種利用PCR擴增目的DNA片段，再使用特異性內切酶消化擴增產物切割成不同大小片段，最后通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測的技術,因僅有正品DNA片段擴增產物被酶切，我們即可依據瓊脂糖凝膠電泳圖中真偽品表現出的不同特征條帶鑒別真偽[27-28]。

《中華人民共和國藥典》2010版第一增補本中收錄了基于ITS序列的中藥川貝母PCR-RFLP鑒別法[28]。張文娟等人[28]用該方法成功鑒別了太白貝母和太白貝母的偽品(伊貝母)，并進一步用基于ITS2的DNA條形碼方法驗證了PCR-RFLP法的準確性。張文娟等人[10]還將川貝母藥材DNA與伊貝母藥材DNA按不同比例混合后，應用PCR-RFLP法進行混合樣品中偽品的檢出限度試驗，結果顯示伊貝母藥材摻入比例低至0.5%時仍可被PCR-RFLP法檢出。周亭亭和孫麗媛科研團隊[29-30]開發了與PCR-RFLP法鑒定圖譜一致的試劑盒法，該方法提取核酸的純度和濃度更好，他們又用此試劑盒法對全國的70份樣品進行真偽鑒定，檢測出川貝母偽品33份，正品川貝母37份，體現出良好的檢測效果。胡偉等人[31]運用PCR-RFLP法對市售中藥川貝母部分樣品進行鑒別時，發現PCR擴增階段還產生了除310 bp的目的條帶外小于250 bp的未知條帶，接著在NCBI進行BLAST序列同源性比對分析后，確認未知條帶是中藥材中常見真菌的ITS1條帶，將下游引物重新設計在中藥川貝母與真菌序列差異較大的ITS2區域，并用改進后的PCR-RFLP方法重新鑒定樣品，結果顯示出其準確性優于中國藥典2015年版中給出的方法。張文娟等人[32]近年運用PCR-RFLP法鑒定暗紫貝母與其偽品時，偽品也在100～250 bp出現2條酶切條帶，他們還搜索NCBI數據庫進行BLAST鑒定暗紫貝母偽品，未鑒定出其屬于哪個貝母植物。

3.2 DNA條形碼技術

DNA條形碼技術是一種利用公認的、相對較短的DNA片段進行物種鑒別的技術，即在所有正品物種中找到相同的一段DNA片段進行測序，作為標準序列保存在數據庫中用來鑒別物種正偽[33-34]。DNA條形碼技術主要操作流程包括：提取樣品的DNA、引物PCR擴增候選片段、測序并分析序列等[35]。其常用分析方法有最近遺傳距離法、BLAST及系統進化關系分析等[36]。2015版《中國藥典》收錄的DNA 條形碼技術指導原則指出植物類藥材應以核糖體DNA內轉錄間隔區ITS2序列為主，葉綠體DNA psbA-trnH序列為輔；而動物類藥材以線粒體DNA COⅠ序列為主，ITS2序列為輔[35]。

羅焜等人[37]應用ITS2序列差異實現了5種經常使用的混偽品(伊犁貝母、平貝母、米貝母、一輪貝母、土貝母)與川貝母的鑒別。鄭輝等人[38]在PCR-RFLP法鑒別川貝母及其近緣種的基礎上，還擴增樣品的ITS2和psbA-trnH條形碼序列進行了分析，結果表明兩種技術均實現了川貝母與其遺傳距離較遠物種(包括平貝母、浙貝母及伊犁貝母)的鑒別，但都未實現川貝母6種基原植物之間以及它們與其它偽品(包括康定貝母、濃蜜貝母、中華貝母、長腺貝母)之間的鑒別。

3.3 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR是指在PCR反應體系中加入熒光探針或熒光染料，通過伴隨整個PCR擴增過程產生的熒光信號累積來對未知模板進行定量分析[39]，實時熒光定量PCR包括TaqMan探針法和SYBR Green I法兩種方法[40]。PCR產物長度或組成不同，其熔解曲線(熔解溫度)也存在差異，因此可根據熔解曲線的差異進行物種的鑒別[41]。

羅達龍等人[42]采用磁珠法提取中藥川貝母中特有DNA片段的同時，按同樣的方法對平貝母、浙貝母、土貝母進行處理后，進行SYBR Green I法試驗。結果提示，除中藥川貝母在PCR時存在拷貝外，平貝母、浙貝母、土貝母無拷貝現象，該結果表明實時熒光定量PCR法可用于中藥川貝母及其混偽品的鑒別。潘杰等人[43]將實時熒光定量PCR(探針法)結合溶解曲線的方法應用到中藥川貝母與伊貝母的鑒別試驗中，分析它們各自的PCR產物形成的熔解曲線時，發現中藥川貝母的熔解溫度Tm為(71.765±0.625)℃，伊貝母Tm為(64.685±0.055)℃。據此可知中藥川貝母與伊貝母的Tm具有特異性，進而就實現了鑒別中藥川貝母和伊貝母的目的。陳慕媛等人[44]還用實時熒光定量PCR(SYBR Green I法)結合溶解曲線鑒別中藥川貝母與常見偽品平貝母、湖北貝母、新疆貝母、浙貝母,結果提示中藥川貝母熔解曲線呈尖銳峰形且Tm為80.98℃，與常見偽品平貝母、湖北貝母、新疆貝母、浙貝母對照藥材的熔解曲線溫度和峰形有明顯差異，據此可知該法也可運用于中藥川貝母及其常見偽品的鑒別。

4 結語

該研究基于地理信息系統對中藥川貝母的產地生態適宜性區劃研究的相關進展進行總結，分別應用TCMGIS系統、GMPGIS系統、遙感技術和最大墑情模型這些現代技術到中藥川貝母產地生態適宜性的研究中，得到了適宜推廣川貝母種植的新區域，相較于傳統靠專家的經驗更加高效[21]。蔣舜媛等人[4]在利用最大墑情模型進行川貝母產地生態適宜性研究的同時，還采用地統學的協同克里金空間插值法將川貝母品質與產地關聯起來開展研究，這樣劃分出來新的適宜種植區域更具有科學性。后來的研究者在推廣其它中藥材品種種植時，可以借用此方法進行深入研究。

PCR-RFLP、DNA條形碼技術、實時熒光定量PCR都能成功鑒別川貝母與其常見偽品(如伊貝母、浙貝母、平貝母)。鄭輝等人[38]的研究表明，PCR-RFLP、ITS2加psbA-trnH條形碼組合技術都未能實現川貝母6種基原植物之間以及它們與其它偽品(康定貝母、濃蜜貝母、中華貝母、長腺貝母)之間的鑒別。

目前，為解決此類近緣種之間無法鑒別的難題，一部分研究者建議應建立以DNA分子鑒定為主，傳統的形狀鑒定、化學鑒別為輔的鑒定體系[45]，比如，國產黑果枸杞和巴西中草藥蒲公英在流通環節都存在使用偽品，顧選等人[46-47]采用類似的研究方法(DNA條形碼-產地-形態分析相結合的方法)，成功區分開真偽品。另一些研究者建議把葉綠體的基因組作為超級條形碼來鑒別物種[48],葉綠體基因組的大小可達到110～160 kb,較DNA片段具有更多的遺傳信息。研究者們借助葉綠體基因組之差異分別實現了豆蔻屬物種(32種)、橐吾屬物種(6種)和石斛屬物種(41種)的鑒別[49]。還有一部分研究者提議從葉綠體基因組中篩選高變異區域[49],李瀅等人[50]在貝母屬4種植物(川貝母、湖北貝母、太白貝母和瓦布貝母)的葉綠體全基因組中開展了相關研究，結果顯示在葉綠體基因區域未篩選到可鑒定貝母屬物種的特異性DNA條形碼，而篩選到的7個葉綠體基因間區可作為貝母屬特異性DNA條形碼的候選片段。同時，以上3種方法的快速實現都建立在人們上傳更多的生物DNA序列到基因數據庫NCBI中。