酶法結(jié)合超聲輔助提取桃兒七鬼臼毒素工藝研究

許顯莉，劉盈盈，馮海生，馬世震*，李彩霞**

(1. 中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧 810008； 2. 青海省青藏高原特色生物資源研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 青海 西寧 810008； 3. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

桃兒七[Sinopodophyllumhexandrum(Royle)Ying]為小檗科桃兒七屬(SinopodophyllumYing)植物的根及根莖[1]，主要分布在我國青海、西藏、四川、甘肅等地區(qū)[2]，具有祛風(fēng)除濕、活血止痛、鎮(zhèn)咳止喘、祛痰等功效[3]。桃兒七中含有大量木脂素類化合物，主要為鬼臼毒素。研究發(fā)現(xiàn)，鬼臼毒素抗腫瘤作用顯著，還具有抗艾滋病、利氣活血、止痛、解毒等活性[4]。此外，鬼臼毒素還可用于依托泊苷、替尼泊苷等抗癌藥物的合成[5-6]。因此，高效低耗提取鬼臼毒素已成為關(guān)注熱點(diǎn)，對抗腫瘤藥物的生產(chǎn)和研發(fā)具有重要意義。

目前，桃兒七鬼臼毒素的提取方法有加熱回流提取法[7]、甲醇冷浸法[8]、超聲波輔助提取法、亞臨界水萃取法[9-11]等，其中超聲輔助提取法應(yīng)用最為廣泛[12]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，酶法提取因提取條件溫和簡單，提取快速高效，減少環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)[13]，在天然產(chǎn)物活性成分提取中得到了廣泛應(yīng)用。而復(fù)合酶可以集合纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等多種酶的共同作用，有效降解細(xì)胞壁及細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)、果膠、纖維素等，更利于活性成分溶出[14]。目前，有關(guān)酶法提取與超聲提取相結(jié)合進(jìn)行桃兒七鬼臼毒素提取的研究報道較少。

鑒于此，本研究使用復(fù)合酶，采用酶法結(jié)合超聲輔助進(jìn)行桃兒七鬼臼毒素的提取，以鬼臼毒素提取得率為評價指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman因素篩選試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法優(yōu)化桃兒七鬼臼毒素的提取工藝條件，并與其他提取工藝(加熱回流提取、索式提取、超聲提取、酶法提取)比較，驗(yàn)證本工藝的高效性，以期為鬼臼毒素的開發(fā)利用提供一定的技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

ML2047型電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；SL -500A型高速萬能粉碎機(jī)(浙江省永康市松青五金廠)；BPG-9140A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(一恒科學(xué)儀器有限公司)；SK3310LHC 型超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；Agilent Infinity 1260 型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4. 6 mm × 250 mm，5 μm)。

1.2 藥材與試劑

2019年9月購買于西安藥材市場的桃兒七；鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，批號：17112303，成都普菲德生物技術(shù)有限公司)；甲酸(色譜純，天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司)；乙腈(色譜純，德國默克股份兩合公司)；甲醇(色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司)；中性蛋白酶(50 u·mg-1)、果膠酶(3×105u·g-1)、纖維素酶(1×104u·g-1)、漆酶(2×104u·g-1)(均為上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

稱取鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)品0. 001 g，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶液溶解并定容至刻度，得濃度為0. 1 μg/μL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

稱取3份過40目篩的桃兒七干燥粉末0.1 g于具塞試管中，分別加入各單因素試驗(yàn)中設(shè)定量的復(fù)合酶(纖維素酶∶果膠酶∶中性蛋白酶∶漆酶=1∶1∶1∶1)，鹽酸水溶液和甲醇水溶液[15]，在選定的料液比、超聲時間、超聲溫度下提取三次，合并三次提取液并定容至25 mL容量瓶中，過0. 22 μm微孔濾膜，得供試品溶液。采用高效液相色譜法測定鬼臼毒素含量，用公式1計(jì)算粗提物中鬼臼毒素提取得率。

(公式1)

m：鬼臼毒素質(zhì)量(g)；M：桃兒七根質(zhì)量(g)

2.3 色譜條件

采用非極性C18(4. 6 mm× 250 mm×5 μm)色譜柱，以乙腈 (A)-0. 04%甲酸水溶液(B)為流動相，梯度洗脫(表1)，流速 0.5 mL/min，柱溫30℃，檢測波長290 nm，進(jìn)樣量10 μL。對照品和樣品色譜圖見圖1。

2.4 線性關(guān)系

吸取2. 1項(xiàng)下配置的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，過 0.22 μm微孔濾膜，依次設(shè)定進(jìn)樣量 2、4、6、8、10、12、14、16 μL，按 2. 3下的色譜條件進(jìn)行測定分析。以對照品質(zhì)量(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析。

表1 梯度洗脫的流動相比例Table 1 The mobile phase ratio of gradient elution

圖1 鬼臼毒素樣品(A)和對照品(B)色譜圖Fig. 1 Chromatogram of sample(A)and control substance(B)of podophyllotoxin

2.5 單因素試驗(yàn)

2.5.1 加酶量對桃兒七鬼臼毒素提取得率的影響

參考劉盈盈[16]等單因素試驗(yàn)方法并稍作調(diào)整，稱取0.1 g桃兒七樣品于25 mL具塞試管，加入1 mL pH為4的鹽酸水溶液，分別加入0.002 g、0.004 g、0.006 g、0.008 g、0.01 g復(fù)合酶，4 mL 82%甲醇溶液，設(shè)定超聲時間20 min，超聲溫度50℃，研究加酶量對桃兒七中鬼臼毒素提取得率的影響。

2.5.2 pH對桃兒七鬼臼毒素提取得率的影響

參考劉盈盈[16]等單因素試驗(yàn)方法并稍作調(diào)整，稱取0.1 g桃兒七樣品于25 mL具塞試管，在液料比1:40(g/mL)，復(fù)合酶加酶量0.004 g，甲醇體積分?jǐn)?shù)82%，超聲時間20 min，超聲溫度50℃的條件下，研究不同pH(2、3、4、5、6)的酸水通過影響酶活性對桃兒七中鬼臼毒素提取得率的影響。

2.5.3 溫度對桃兒七鬼臼毒素提取得率的影響

參考劉盈盈[16]等單因素試驗(yàn)方法并稍作調(diào)整，稱取0.1 g桃兒七樣品于25 mL具塞試管，加入1 mL pH為3的酸水和0.004 g復(fù)合酶，在液料比1:40(g/mL)，甲醇體積分?jǐn)?shù)82%，超聲時間20 min的條件下，研究不同超聲溫度(20℃、30℃、40℃、50℃、60℃)對桃兒七中鬼臼毒素提取得率的影響。

2.5.4 甲醇體積分?jǐn)?shù)對桃兒七鬼臼毒素提取得率的影響

參考劉盈盈[16]等單因素試驗(yàn)方法并稍作調(diào)整，稱取0.1 g桃兒七樣品于25 mL具塞試管，加入1 mL pH為3的酸水和0.004 g復(fù)合酶，在液料比1:40(g/mL)，超聲溫度30℃，超聲時間20 min的條件下，研究不同甲醇體積分?jǐn)?shù)(30%、40%、50%、60%、70%)對桃兒七中鬼臼毒素提取得率的影響。

2.5.5 料液比對桃兒七鬼臼毒素提取得率的影響

參考劉盈盈[16]等單因素試驗(yàn)方法并稍作調(diào)整，稱取0.1 g桃兒七樣品于25 mL具塞試管，加入1 mL pH為3的酸水和0.004 g復(fù)合酶，在甲醇體積分?jǐn)?shù)50%，超聲溫度30℃，超聲時間20 min的條件下，研究不同料液比1:10、1:20、1:30、1:40、1:50(g/mL)對桃兒七中鬼臼毒素提取得率的影響。

2.5.6 超聲時間對桃兒七鬼臼毒素提取得率的影響

參考劉盈盈[16]等單因素試驗(yàn)方法并稍作調(diào)整，稱取0.1 g桃兒七樣品于25 mL具塞試管，加入1 mL pH為3的酸水和0.004 g復(fù)合酶，在液料比1:40(g/mL)，甲醇體積分?jǐn)?shù)50%，超聲溫度30℃的條件下，研究不同超聲時間(5 min、10 min、15 min、20 min、25 min)對桃兒七中鬼臼毒素提取得率的影響。

2.6 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

由于本研究探究的因素較多，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選出影響較大的幾個因素作為響應(yīng)面試驗(yàn)的影響因子，通過Plackett-Burman對單因素試驗(yàn)的六個因素進(jìn)行考察，依次標(biāo)為A～F，每個因素取低水平“-1”和高水平“1”，響應(yīng)值為鬼臼毒素提取得率，因素水平表見表2。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of Plackett-Burman

2.7 酶法輔助超聲提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，將Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出的對桃兒七鬼臼毒素提取得率影響較大的三個因素料液比(X1)g/mL，甲醇體積分?jǐn)?shù)(X2)%和超聲時間(X3)min作為響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)(BBD)的變量，以鬼臼毒素提取得率為衡量指標(biāo)進(jìn)行考察。BBD設(shè)計(jì)以隨機(jī)順序進(jìn)行17組試驗(yàn)，其中包括12個因析試驗(yàn)組，5個重復(fù)的中心點(diǎn)試驗(yàn)組。三個變量分別指定為X1、X2、X3進(jìn)行組合，自變量的水平編碼為-1、0和1，即分別表示低、中和高值，響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平編碼見表3。

表3 桃兒七鬼臼毒素提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素及水平編碼Table 3 Independent variables and their coded and actual values used in the response surface

為了預(yù)測最佳的優(yōu)化條件，采用Design-Expert 8.0.6軟件就試驗(yàn)結(jié)果做回歸分析，得到擬合二階多項(xiàng)式模型(公式2)，該回歸系數(shù)擬合相關(guān)聯(lián)的變量和響應(yīng)值。

(公式2)

Y為預(yù)測響應(yīng)值，k為變量的個數(shù)(k=3)；Xi和Xj為自變量編碼水平(i≠j)；β0為常數(shù)項(xiàng)；βj為線性回歸系數(shù)，βjj為二次項(xiàng)回歸系數(shù)；βij為交互項(xiàng)回歸系數(shù)。

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman因素篩選試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化后，在最佳提取工藝條件下，進(jìn)行三次平行提取試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

2.9 其他提取方法

2.9.1 加熱回流提取

參考王萍等[17]研究，熱回流提取工藝為：稱取1 g干燥的桃兒七原料，置于50 mL圓底燒瓶中。在選定乙醇濃度53%、液料比16∶1(mL/g)、提取時間40 min、提取溫度42℃條件下熱回流提取，共提取三次，提取液過濾并定容至50 mL容量瓶，過 0.22 μm 微孔濾膜，得供試品溶液。

2.9.2 索式提取

參考張成等[18]研究并加以調(diào)整，索式提取工藝為：稱取桃兒七樣品1 g，用濾紙包好，置索氏提取器中，加 100 mL 75%乙醇，設(shè)定提取溫度85℃，提取時間8 h，抽濾得提取液，經(jīng)旋蒸濃縮后定容至50 mL容量瓶，過 0. 22 μm 微孔濾膜，得供試品溶液。

2.9.3 超聲輔助提取

參考劉盈盈等[16]研究進(jìn)行超聲輔助提取，得供試品溶液。

2.9.4 酶法提取

參考余美瓊等[19]研究并加以調(diào)整，酶法提取工藝流程為：準(zhǔn)確稱取過40目篩的桃兒七粉末于25 mL具塞試管中，分別加入4%的復(fù)合酶、pH 3的酸水和3 mL 50%的甲醇溶液，將試管置于30℃水浴鍋中提取20 min，共提取三次，合并提取液，抽濾并定容至10 mL 的容量瓶中，過 0. 22 μm 微孔濾膜，得供試品溶液。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 線性關(guān)系考察

按照“2.4”項(xiàng)色譜條件依次進(jìn)樣，測定峰面積。以峰面積積分值(Y)對進(jìn)樣量(X)進(jìn)行線性回歸，得鬼臼毒素回歸方程為 Y=1 678.7 X+14.079，r=0.9999，表明鬼臼毒素在 0.2～1.6 μg 具有良好線性關(guān)系，線性關(guān)系見圖2。

圖2 線性關(guān)系Fig. 2 Linear relationship

3.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 加酶量對鬼臼毒素提取得率的影響

由圖3(A)可知，加酶量為0.002 g時，鬼臼毒素提取得率較低；當(dāng)加酶量增至0.004 g時，得率明顯上升；當(dāng)加酶量由0.004 g增至0.008 g時，得率無明顯變化；當(dāng)加酶量變?yōu)?.01 g時，得率明顯下降。由于酶的添加量可以決定酶活力，大量的復(fù)合酶可以促進(jìn)提取效果，但同時會增加提取成本[20]，因此，復(fù)合酶的最適用量為0.004 g。

3.2.2 pH對鬼臼毒素提取得率的影響

從圖3(B)可得， pH為3時，鬼臼毒素提取得率最高，說明此時復(fù)合酶活力最高對底物的綜合作用效果達(dá)到最大。因此，最適酶解pH為3，與文獻(xiàn)中復(fù)合酶的最適pH范圍2～6吻合[21]。

3.2.3 溫度對鬼臼毒素提取得率的影響

從圖3(C)可得，當(dāng)提取溫度從20℃上升到30℃時，鬼臼毒素提取得率隨之增加；當(dāng)提取溫度增至30℃以上時，提取得率隨之降低。溫度通過控制酶活性來影響提取得率，溫度升高會提高酶的活性和分子運(yùn)動，加速細(xì)胞內(nèi)活性成分釋放和溶劑進(jìn)入，但過高的溫度會使酶變性，降低酶活性[22]，因此最適提取溫度為30℃。

3.2.4 超聲時間對鬼臼毒素提取得率的影響

由圖3(D)可知，在超聲時間為10 min時，鬼臼毒素提取得率最高。溶劑的滲入以及活性成分的溶出都需要一定的時間。當(dāng)超聲時間小于10 min時，提取不充分，鬼臼毒素溶出較少，導(dǎo)致得率較低；當(dāng)超聲時間大于10 min后，鬼臼毒素的穩(wěn)定性變差，同時引起其他物質(zhì)溶出，使目標(biāo)化合物含量相對下降[23]。因此，最適超聲時間為10 min。

3.2.5 甲醇體積分?jǐn)?shù)對鬼臼毒素提取得率的影響

由圖3(E)可得，在甲醇體積分?jǐn)?shù)為50%時，鬼臼毒素提取率最高。這說明提取溶劑的濃度對鬼臼毒素的溶出有一定的影響，濃度太低，提取不完全；濃度太高，可能會因?yàn)槠渌钚猿煞值娜艹鲇绊懩繕?biāo)化合物的得率，且造成有機(jī)溶劑的浪費(fèi)[24]。因此，桃兒七鬼臼毒素提取的最適甲醇體積分?jǐn)?shù)為50%。

3.2.6 料液比對鬼臼毒素提取得率的影響

由圖3(F)可知，當(dāng)料液比由1∶10(g/mL)變?yōu)?∶30(g/mL)，鬼臼毒素提取得率隨之增加；當(dāng)料液比由1∶30(g/mL)變?yōu)?∶50(g/mL)，提取得率緩慢降低。因此，桃兒七鬼臼毒素提取的最適料液比為1∶30(g/mL)。

圖3 不同因素對鬼臼毒素提取得率的影響Fig. 3 The effect of different factors to the yield of podophyllotoxin

3.3 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果及分析

根據(jù)2.6進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表4，用Minitab 17軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行逐步回歸分析，各因素的顯著性檢驗(yàn)見表5。

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果 (N=12)Table 4 The results of Plackett-Burman

表5 各因素的顯著性檢驗(yàn)Table 5 Significance test of each factor

Plackett-Burman回歸模型的P=0.022<0.05，模型顯著，具有一定的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[25]。由表5中的回歸系數(shù)及P值得：六個因素中，甲醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時間對桃兒七鬼臼毒素提取得率影響顯著，因此，選用這三個因素設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，設(shè)定其他因素在單因素試驗(yàn)下的最佳水平進(jìn)行試驗(yàn)。

3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

3.4.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與回歸模型的建立

本研究以料液比(X1)mL、甲醇體積分?jǐn)?shù)(X2)%、超聲時間(X3)min 3個因素為自變量，以鬼臼毒素提取得率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)(BBD)，RSM試驗(yàn)組合及桃兒七鬼臼毒素得率見表6。

為了更好地預(yù)測酶法結(jié)合超聲輔助提取的效率、變量及因變量之間的關(guān)系，對桃兒七鬼臼毒素提取率(%)進(jìn)行回歸擬合，結(jié)果如公式3所示，其中Y表示鬼臼毒素得率，變量X1表示料液比(g/mL)，X2表示甲醇體積分?jǐn)?shù)(%)，X3表示超聲時間(min)。

表6 RSM試驗(yàn)組合及桃兒七鬼臼毒素得率Table 6 Box-Behnken experimental design and results for total PPT extraction yields

Y=5.18+0.096X1+0.063X2+0.021X3-5×10-3X1X2-7.5×10-3X1X3+0.0000X2X3-0.077X12-0.074X22-0.087X32

(公式3)

為了檢驗(yàn)試驗(yàn)數(shù)據(jù)均數(shù)差別的顯著性，用方差分析(ANOVA)分析二階多項(xiàng)式模型的準(zhǔn)確性和適合度。由表7可知，模型P值<0.0001，說明鬼臼毒素提取率的回歸模型極顯著。同時對線性系數(shù)(X1，X2和X3)、二次項(xiàng)系數(shù)(X12，X22和X32)和交互作用系數(shù)(X1X2，X1X3和X2X3)的顯著性進(jìn)行P值檢驗(yàn)，料液比(X1)和甲醇體積分?jǐn)?shù)(X2)線性系數(shù)均為極顯著，提取時間(X3)的線性系數(shù)為顯著，X1X2，X1X3和X2X3的交互作用為不顯著。二次項(xiàng)系數(shù)(X12，X22和X32)均為極顯著。以上數(shù)據(jù)表明，三因素中部分因素與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，即在本研究中分析的部分變量是影響鬼臼毒素提取率的重要因素。

系數(shù)也稱R2，通常用于衡量模型的準(zhǔn)確性，本試驗(yàn)中所得的R2為0.984 6，充分表明該模型是一個合理的擬合試驗(yàn)。此外，調(diào)整確定系數(shù)值(adj- R2)為0.964 9，預(yù)測系數(shù)值(pre- R2)為0.8631，該數(shù)據(jù)表明得到的試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測值有顯著性差異。變異系數(shù)(C.V.)為0.42，表明獲得的試驗(yàn)值具可靠性[26]。因此，該BBD模型中多項(xiàng)式的回歸模型與實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果相匹配。

表7 回歸模型中回歸系數(shù)方差分析Table 7 ANOVA for response surface quadratic model

3.4.2 兩因素交互影響的響應(yīng)面分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件擬合的料液比(X1)、甲醇體積分?jǐn)?shù)(X2)、超聲時間(X3)三個因素的交互作用對響應(yīng)值鬼臼毒素提取得率(Y)的影響如圖4、5、6所示，可以直觀得到提取工藝變量對桃兒七鬼臼毒素提取得率的影響。

由圖4可知，等高線圖(a)呈橢圓，說明料液比和甲醇體積分?jǐn)?shù)兩因素間的交互作用明顯[27]；從三維響應(yīng)面圖(b)得，鬼臼毒素提取率隨料液比和甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加有顯著的上升趨勢，響應(yīng)面圖坡度較陡，且料液比的變化坡度及等高線數(shù)量高于甲醇體積分?jǐn)?shù)，表明料液比對鬼臼毒素提取率的影響高于甲醇體積分?jǐn)?shù)[28]。

由圖5可知，等高線圖(c)呈圓形，說明料液比和超聲時間兩因素間的交互作用不顯著；從三維響應(yīng)面圖(d)得，鬼臼毒素提取率隨料液比和超聲時間的增加有顯著的上升趨勢，響應(yīng)面圖坡度較陡，且料液比的變化坡度高于超聲時間，表明料液比對鬼臼毒素提取率的影響高于超聲時間，說明足夠的提取溶劑才能使目標(biāo)化合物提取充分，目標(biāo)化合物的得率受提取溶劑劑量的影響較大。

由圖6可知，等高線圖(e)呈橢圓，說明甲醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時間兩因素間的交互作用顯著；從三維響應(yīng)面圖(f)得，鬼臼毒素提取率隨甲醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時間的增加呈先上升后略微下降的趨勢，響應(yīng)面圖坡度較陡，且甲醇體積分?jǐn)?shù)的變化坡度高于超聲時間，表明甲醇體積分?jǐn)?shù)對鬼臼毒素提取率的影響高于超聲時間，且較長時間和較高濃度的甲醇都不利于鬼臼毒素的溶出。

3.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過Design Expert軟件分析，酶法結(jié)合超聲輔助提取桃兒七鬼臼毒素的最優(yōu)參數(shù)為：料液比為1∶30 (g/mL)，甲醇體積分?jǐn)?shù)為50%，超聲時間為10 min ，在此條件下，桃兒七鬼臼毒素提取得率的預(yù)測值為 5.19% ，實(shí)際值為 5.2%(n=3)，實(shí)際值與預(yù)測值接近，說明所確定的最優(yōu)工藝條件穩(wěn)定可靠。

3.5 不同提取工藝的比較

為比較采用不同提取工藝的鬼臼毒素提取得率，本研究參考前人研究的工藝方法分別進(jìn)行提取，不同提取方法下的鬼臼毒素提取得率見圖7。

圖4 不同料液比(X1)和甲醇體積分?jǐn)?shù)(X2)對鬼臼毒素得率影響的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig. 4 The contour figure and response surface figure of variable parameters including ratio of material to liquid(X1)and methanol volume fraction(X2)on the yield of the extracted podophyllotoxin

圖5 同料液比(X1)和超聲時間(X3)對鬼臼毒素得率影響的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig. 5 The contour figure and response surface figure of variable parameters including ratio of material to liquid(X1))and ultrasonic time (X3) on the yield of the extracted podophyllotoxin

圖6 不同甲醇體積分?jǐn)?shù)(X2)和超聲時間(X3)對鬼臼毒素得率影響的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig. 6 The contour figure and response surface figure of variable parameters including methanol volume fraction (X2) and extraction time (X3) on the yield of the extracted podophyllotoxin

圖7 不同提取方法下桃兒七中鬼臼毒素提取得率Fig. 7 The yield of podophyllotoxin in different extraction methods

4 結(jié)論與討論

本研究利用酶法結(jié)合超聲輔助提取桃兒七中鬼臼毒素，經(jīng)單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman因素篩選試驗(yàn)、響應(yīng)面優(yōu)化得出桃兒七鬼臼毒素的最佳提取工藝條件為：復(fù)合加酶量0.004 g、酶解pH 3 、酶解溫度 30℃、料液比1∶30(g/mL)、甲醇體積分?jǐn)?shù)50% 、超聲時間10 min。此條件下鬼臼毒素提取率為5.20%，提取得率較加熱回流提取、索式提取、酶法提取、超聲提取分別增加了1.55%、1.7%、1.51%、1.54%。綜上，相比于單一的提取方法，酶法結(jié)合超聲功輔助提取在桃兒七鬼臼毒素提取中更具有優(yōu)勢。

一般大量的提取溶劑可以提高溶劑在細(xì)胞中的擴(kuò)散速率，并從樣品中溶解更多的活性成分[29]。但本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)料液比大于1∶30 (g/mL)時，隨著溶劑比例的增加，鬼臼毒素得率反而下降。一方面，這可能是因?yàn)橐毫媳仍龃螅概c底物接觸機(jī)會反而降低，導(dǎo)致細(xì)胞壁降解減慢，鬼臼毒素溶出減少。另一方面，這可能由于當(dāng)加入溶劑過多時，非目標(biāo)化合物的溶出影響了鬼臼毒素的溶出[30]。

對比本研究中不同提取工藝，提取時長的排序順序?yàn)椋核魇教崛?加熱回流提取>酶法提取>超聲提取>酶法結(jié)合超聲提取；鬼臼毒素得率的排序順序?yàn)椋好阜ńY(jié)合超聲提取>酶法提取>超聲提取>加熱回流提取>索式提取；液料比的排序順序?yàn)椋核魇教崛?加熱回流提取>超聲提取>酶法提取 >酶法結(jié)合超聲提取。劉盈盈[16]等采用超聲法提取桃兒七鬼臼毒素時，最高得率為4.18%。本研究將酶法與超聲輔助提取結(jié)合后，所需提取時間較短，提取溫度較低，溶劑消耗減少，鬼臼毒素提取得率較高。

采用酶法結(jié)合超聲輔助提取桃兒七鬼臼毒素達(dá)到高效低耗的原因主要有以下兩方面。首先，鬼臼毒素的提取主要受到植物細(xì)胞壁及細(xì)胞質(zhì)中的大分子蛋白質(zhì)、纖維素、淀粉、果膠、木質(zhì)素等物質(zhì)影響。本研究中纖維素酶能夠催化水解纖維素，中性蛋白酶能夠高效水解蛋白質(zhì)，漆酶能夠催化木質(zhì)素類成分的降解，而果膠酶具有對果膠的解酯、水解和破裂作用。酶的專一性和反應(yīng)條件溫和的特點(diǎn)使鬼臼毒素的構(gòu)象和生物活性不被遭到破壞[31]，四種酶相互作用，使提取得率高于單一酶作用效果，更優(yōu)于無酶工藝[32]。其次，超聲提取利用超聲波的空化作用、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)等加速胞內(nèi)鬼臼毒素的釋放、擴(kuò)散和溶解。這也說明，兩種或多種簡便提取方法的耦合集成，結(jié)合不同優(yōu)勢，是未來天然產(chǎn)物有效成分提取制備的發(fā)展趨勢。