1例輸入性HIV-1 G亞型毒株的檢出及基因組序列分析

杜 波，李 賀，羅周正，馬玉霞，劉文新，趙 地，吳 瑩，郭 勇，田曉東

HIV-1為反轉(zhuǎn)錄病毒屬正鏈RNA病毒，由于病毒復(fù)制過(guò)程缺少校對(duì)功能，具有高度變異性。HIV-1除少數(shù)為N組和O組外，大部分屬于M組，而M組又可分為9個(gè)亞型和102個(gè)重組亞型[1-2]。隨著基因測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，越來(lái)越多的HIV基因組得到測(cè)序，這為分析HIV亞型、流行趨勢(shì)、分子溯源提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也對(duì)制定有效的艾滋病防治措施提供科學(xué)依據(jù)[3-5]。HIV-1亞型中，G亞型主要分布于西非和歐洲，其感染者只占全球感染者的4.6%；但G亞型出現(xiàn)時(shí)間較長(zhǎng)，隨著病毒的變異和重組，G亞型與HIV-1其他亞型重組產(chǎn)生的重組亞型廣泛流行。例如，重組亞型CRF02_AG就是由HIV-1 A亞型和G亞型重組而成，CRF02_AG重組亞型感染者占全球感染者的7.7%[6]。

阜新地區(qū)流行的HIV-1毒株亞型呈現(xiàn)復(fù)雜趨勢(shì)。2009年以前，主要以B亞型感染為主；2009年以后，以CRF01_AE亞型感染居多，亞型種類(lèi)包括B亞型、CRF07_BC亞型和CRF65_cpx亞型，但之前本地區(qū)未發(fā)現(xiàn)過(guò)G亞型。在2019年的艾滋病監(jiān)測(cè)中，首次監(jiān)測(cè)到本地區(qū)有1例輸入性HIV-1 G亞型感染者，本文對(duì)其體內(nèi)的HIV-1基因組進(jìn)行序列測(cè)定和進(jìn)化分析，為本病例病毒溯源提供依據(jù)，也為本地區(qū)HIV-1流行趨勢(shì)提供預(yù)測(cè)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 本病例來(lái)自阜新市衛(wèi)生健康服務(wù)中心（阜新市疾病預(yù)防控制中心）艾滋病監(jiān)測(cè)人群，為艾滋病WHO臨床分期I期的尼日利亞來(lái)華人員，血清樣本編號(hào)FX2019042，經(jīng)ELISA、膠體金篩查和免疫印跡確證試驗(yàn)確認(rèn)為HIV-1抗體陽(yáng)性。在確保患者知情同意的前提下，采集患者血清2 ml，凍存于-70 ℃冰箱備用。

1.2 HIV-1 RNA提取 采用RNA病毒提取試劑盒QIAamp Viral RNA Mini Kit（QIAGEN公司，貨號(hào)52904）提取血清樣品中的HIV-1 RNA，具體操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取的RNA凍存于-70 ℃冰箱備用。

1.3 HIV-1 RT-PCR擴(kuò)增 由于樣本珍貴，先將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板，進(jìn)行兩輪PCR，最后進(jìn)行測(cè)序。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。反應(yīng)過(guò)程簡(jiǎn)述如下。RT-PCR反應(yīng)體系總體積50 μl，體系成分包括：1 μl反轉(zhuǎn)錄酶（0.5 U/μl）、25 μl 2× 緩沖溶液，10 μl模板RNA，5 μl隨機(jī)引物及 2 μl dNTP，用水補(bǔ)足至50 μl。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為 50 ℃溫育50 min，85 ℃5 min終止反應(yīng)。用2×Taq PCR Master Mix試劑盒（日本TaKaRa公司）進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，其PCR產(chǎn)物為近似全長(zhǎng)基因組，上游引物為UFA，下游引物為URB。PCR反應(yīng)體系總體積50 μl，體系成分包括：25 μl 2×Taq PCR Master Mix混合液、2 μl cDNA 模板、2 μl上下游引物（10 μmol/L），用水補(bǔ)足至 50 μl。PCR反應(yīng)條件如下：95 ℃ 10 min；95 ℃ 60 s，55 ℃ 60 s，70 ℃ 10 min，進(jìn)行 40 個(gè)循環(huán)；終延伸72 ℃ 10 min。用2×Taq PCR Master Mix試劑盒（日本TaKaRa公司）進(jìn)行第二輪巢式PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系和條件同第一輪PCR反應(yīng)。所有引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR 引物序列表Table 1 Sequence of RT-PCR primers

1.4 PCR產(chǎn)物的純化和測(cè)序 PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)目的條帶切膠回收，使用QIAGEN公司（德國(guó)）QIAquick Gel Extraction Kit對(duì)切膠產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化后的產(chǎn)物委托Invitrigen公司進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.5 序列分析 用Chromas軟件查看測(cè)序序列峰圖，序列編輯使用Sequencher 4.0軟件，最后用BioEdit 6.1軟件對(duì)序列進(jìn)行拼接，基因位置的繪圖和分析采用HIV Sequence Locator軟件。從HIV Database （https://www.hiv.lanl.gov）下載HIV-1各亞型參考毒株基因組序列，使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，計(jì)算參數(shù)設(shè)定為Bootstrap值500次。在GenBank中下載所有G亞型基因組序列，利用NCBI BLAST在線比對(duì)G亞型各基因與本研究毒株各基因相似度。對(duì)獲得的基因組序列，使用RIP 3.0軟件進(jìn)行基因重組分析，并將序列中env基因C2V3區(qū)序列應(yīng)用Gene Cutter軟件搜索并翻譯為氨基酸序列。所得到的氨基酸序列使用Geno2pheno軟件進(jìn)行輔助受體預(yù)測(cè)，輔助受體判定標(biāo)準(zhǔn)：假陽(yáng)性率＜5%判定為病毒使用趨化性細(xì)胞因子受體4（chemokine cysteine-X-cysteine motif receptor 4,CXCR4）為輔助受體；5%～15%判定為趨化性細(xì)胞因子受體5（chemokine cysteinecysteine motif receptor 5,CCR5）/CXCR4雙嗜性輔助受體；＞15%判定為CCR5為輔助受體。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用EpiData 3.1 軟件錄入數(shù)據(jù)，采用SPSS 23.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示。

2 結(jié) 果

2.1 近似全長(zhǎng)基因組分析 經(jīng)過(guò)測(cè)序，所獲得的7個(gè)片段經(jīng)拼接后，序列全長(zhǎng)為8695 bp。基因組中，4種堿基分別為：3199A、1491C、2071G、1934T，嘌呤（A+G）占 60.6%（5270/8695），毒株符合反轉(zhuǎn)錄病毒基因組堿基組成特征，將此毒株編號(hào)為FX2019042。經(jīng)HIV Sequence Locator軟件分析，F(xiàn)X2019042 從 5′-3′分 別 為 gag、pol、vif、vpr、tat、vpu、env、rev和 nef共 9個(gè)基因，參照HIV-1標(biāo)準(zhǔn)毒株HXB2，F(xiàn)X2019042毒株的序列位置見(jiàn)圖1。

圖1 FX2019042毒株基因序列位置圖Figure 1 FX2019042 strain gene sequence location map

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析 在HIV Database中下載A～D、F～H、J～K各亞型及其常見(jiàn)重組亞型的參考株全長(zhǎng)序列，使用Kimura2-parameter模型，繪制Neighbor-Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（見(jiàn)圖2）。FX2019042毒株與G亞型參考株G.KE.1993.HH8793基因離散率為9.96%，并與其他G亞型參考株親緣關(guān)系相近，Bootstrap值為98%，提示該毒株為G亞型毒株。

圖2 FX2019042毒株與各亞型參考株全長(zhǎng)序列進(jìn)化分析★.FX2019042毒株Figure 2 Full-length sequence phylogenetic tree of FX2019042 and reference strains of each subtype

為了在分子生物學(xué)上進(jìn)一步確定FX2019042毒株的來(lái)源，將GenBank中6株國(guó)內(nèi)G亞型毒株和17株國(guó)外G亞型毒株與FX2019042一起繪制進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示，我國(guó)的G亞型呈散在分布，F(xiàn)X2019042毒株與尼日利亞流行株G.NG.1995.NG1937.AF069937親緣關(guān)系最近，基因離散率為8.95%（見(jiàn)圖3）。GenBank中G亞型HIV基因組序列共142條，將FX2019042毒株的3個(gè)結(jié)構(gòu)基因和6個(gè)非結(jié)構(gòu)基因序列分別與G亞型HIV基因組中各基因比對(duì)，獲得相似度分值，基因序列相似度比較結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，F(xiàn)X2019042毒株發(fā)生變異最大的主要基因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)基因env和非結(jié)構(gòu)基因tat。

圖3 FX2019042毒株與G亞型參考株進(jìn)化分析★.FX2019042毒株；●.與FX2019042毒株親緣關(guān)系最近的G亞型毒株；△.國(guó)外G亞型毒株；▲.國(guó)內(nèi)G亞型毒株Figure 3 Phylogenetic tree of FX2019042 strain and subtype G reference strain

表2 FX2019042毒株各基因與G亞型各基因序列相似度比較Table 2 Comparison of sequence similarity between each gene of FX2019042 strain and each gene of G subtype

2.3 基因重組分析 為了檢測(cè)FX2019042毒株基因組是否存在重組片段，我們使用在線軟件RIP3.0對(duì)FX2019042毒株進(jìn)行重組分析，參數(shù)設(shè)置：windowsize=400，confidence threshold=90%，gapoption=3，multistate characters=yes。FX2019042毒株基因組序列重組分析結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示，未發(fā)現(xiàn)FX2019042毒株基因組序列與HIV-1的A～D、F～H、J～K的9個(gè)亞型發(fā)生重組，提示該毒株為純粹的HIV-1 G亞型毒株。

圖4 FX2019042毒株基因重組分析X軸表示序列在移動(dòng)的窗口中心的位置；Y軸表示與參考毒株相似程度Figure 4 Analysis of FX2019042 strain gene recombination

2.4 糖蛋白GP120分析 GP120的糖基化過(guò)程對(duì)于蛋白質(zhì)的折疊至關(guān)重要，在HIV感染人體T淋巴細(xì)胞過(guò)程中，GP120通過(guò)糖基化使病毒吸附于T淋巴細(xì)胞，而且HIV可以利用糖基來(lái)阻塞抗體表位而逃避人體免疫系統(tǒng)。含511個(gè)氨基酸的GP120中，V1～V5為可變區(qū)，C1～C5為恒定區(qū)。對(duì)FX2019042毒株的GP120的可變區(qū)和糖基化程度進(jìn)行分析，結(jié)果顯示FX2019042毒株V3區(qū)有1個(gè)氨基酸缺失，在GP120區(qū)域共有25個(gè)糖基化位點(diǎn)，但其中8個(gè)位點(diǎn)因多糖空洞而導(dǎo)致糖基化位點(diǎn)缺失（見(jiàn)圖5）。在輔助受體方面，對(duì)V3區(qū)關(guān)鍵氨基酸的分析顯示，F(xiàn)X2019042毒株V3區(qū)氨基酸序列為CVRPNNNTRRSIHFGPGQA IYTTGIIGDIRQAHC，預(yù)測(cè)此毒株利用 CCR5作為輔助受體。

圖5 FX2019042毒株GP120糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)黃色部分代表缺失的糖基化位點(diǎn)Figure 5 Prediction of GP120 glycosylation sites of FX2019042 strain

3 討 論

HIV-1 G亞型為古老的HIV-1亞型，在全球的流行分布極不平衡，主要集中在西非的尼日利亞和喀麥隆等地區(qū)。而G亞型與其他亞型重組形成的重組亞型則廣泛分布[6-7]，在我國(guó)常見(jiàn)的為CRF02_AG流行重組型，在世界范圍內(nèi)，雖然G亞型感染者只占全部HIV-1感染者的5.0%，但CRF02_AG感染者占全部HIV-1感染者的7.7%。在G亞型的發(fā)源地西非地區(qū)，67%的HIV-1感染者中能檢測(cè)到G亞型基因片段[7]，可見(jiàn)G亞型毒株極易與其他毒株發(fā)生重組并獲得傳播優(yōu)勢(shì)，需要加強(qiáng)對(duì)本地區(qū)的HIV流行株嚴(yán)密監(jiān)測(cè)，防止新型重組毒株的出現(xiàn)及流行。

我國(guó)發(fā)現(xiàn)的HIV-1 G亞型毒株較少，僅重慶、上海和廣西有相關(guān)報(bào)道[3，8-9]。我國(guó)在重慶市首次檢測(cè)到G亞型毒株[8]，根據(jù)HIV傳統(tǒng)分型基因env，鑒定為G亞型，但是由于只測(cè)序了env基因的686 bp，無(wú)法排除此毒株為CRF02_AG重組亞型的可能[3，9]。在2019年的艾滋病監(jiān)測(cè)中，本課題組發(fā)現(xiàn)了1例HIV-1 G亞型毒株，對(duì)其進(jìn)行基因組測(cè)序，RIP 3.0軟件分析顯示FX2019042為純G亞型，構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示FX2019042毒株與尼日利亞毒株親緣關(guān)系最近，與在廣西等地發(fā)現(xiàn)的G亞型毒株親緣關(guān)系較近[3，10]，但與上海分離株sh52親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，推測(cè)FX2019042毒株為境外輸入型毒株。

HIV-1感染人體細(xì)胞除了需要與CD4+T淋巴細(xì)胞受體結(jié)合外，還需要env基因編碼的輔助受體CCR5和CXCR4[1，11-12]。這兩種受體為HIV-1進(jìn)入人體細(xì)胞的主要輔助受體，在艾滋病不同時(shí)期HIV-1使用的輔助受體不同，在HIV-1感染早期，體內(nèi)病毒準(zhǔn)種常以CCR5為輔助受體，隨著病情進(jìn)展，病毒利用的輔助受體向CXCR4過(guò)渡，在感染晚期則利用CXCR4輔助受體[1，3-15]。由于GP120的糖基化過(guò)程對(duì)于HIV-1感染細(xì)胞至關(guān)重要，而且HIV可以利用糖基來(lái)阻塞抗體表位而逃避機(jī)體免疫功能[12，15]，所以本研究在基因序列分析基礎(chǔ)上，對(duì)FX2019042毒株的GP120可變區(qū)和糖基化程度進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)X2019042毒株準(zhǔn)種進(jìn)入CD4+T淋巴細(xì)胞時(shí)利用的輔助受體為CCR5，這與該患者病程為艾滋病發(fā)病早期相符。

綜上，本研究對(duì)艾滋病監(jiān)測(cè)獲得的HIV-1 G亞型近似全長(zhǎng)基因組序列進(jìn)行研究，從分子流行病學(xué)角度證實(shí)該毒株為境外輸入型毒株，這與該感染者流行病學(xué)史相符。此毒株序列的測(cè)定和分析對(duì)于本地區(qū)HIV流行趨勢(shì)和HIV毒株多樣性研究均具有重要意義，提示我們需加強(qiáng)艾滋病監(jiān)測(cè)，防止境外毒株與本地毒株發(fā)生重組和流行。