腎綜合征出血熱患者血清鐵蛋白水平變化研究

胡海峰，連建奇，王曉艷，王平忠，白雪帆，李 璟，杜 虹

鐵蛋白（ferritin,FRT）作為機(jī)體內(nèi)一種鐵儲(chǔ)存的可溶性大分子組織蛋白質(zhì),是去鐵蛋白和鐵核心Fe3+形成的復(fù)合物。FRT主要存在于肝臟、脾臟和骨髓的網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，正常情況下為骨髓合成血紅蛋白供鐵，并根據(jù)機(jī)體需要向血清中釋放，可維持血紅蛋白相對(duì)穩(wěn)定，故臨床常將FRT水平作為體內(nèi)缺鐵或鐵過(guò)量的指標(biāo)[1]。

目前認(rèn)為，血清FRT水平不僅受鐵代謝的影響，還受感染、細(xì)胞更新、組織壞死等炎癥活動(dòng)的影響。FRT通過(guò)不同的機(jī)制調(diào)節(jié)免疫活動(dòng)，包括促凋亡和抗凋亡通路以及誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的合成[2]。隨著對(duì)FRT研究的不斷深入，大量數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)RT與冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、急性腦梗死、腦出血、骨髓增生異常綜合征、非酒精性脂肪肝、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、抗心磷脂綜合征、噬血細(xì)胞綜合征、Ⅱ型糖尿病等疾病密切相關(guān)[3-6]。此外，越來(lái)越多的研究表明，F(xiàn)RT可作為一種新型的評(píng)價(jià)機(jī)體炎性狀態(tài)和氧化應(yīng)激的指標(biāo)[7]。FRT增高可能還與炎癥及感染有關(guān)，其有助于早期評(píng)估膿毒癥的嚴(yán)重程度，預(yù)測(cè)患者預(yù)后[8-9]。

在病毒感染方面，近年來(lái)亦有研究表明，F(xiàn)RT與埃博拉出血熱和克里米亞-剛果出血熱患者的病毒血癥、出血風(fēng)險(xiǎn)和死亡相關(guān)[10-11]，但是對(duì)漢坦病毒所致腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS）患者病程中FRT動(dòng)態(tài)變化的相關(guān)研究較少[12]。本研究基于上述背景，以2011年10月—2013年12月我院收治的102例HFRS確診患者為研究對(duì)象，觀察不同分型、不同分期HFRS患者血清FRT水平變化，探討其對(duì)HFRS嚴(yán)重程度及預(yù)后（死亡）評(píng)估的價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 收集空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院傳染科2011年10月—2013年12月收治的符合納排標(biāo)準(zhǔn)的102例HFRS患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合HFRS典型臨床表現(xiàn)且經(jīng)血清學(xué)檢查（HFRS特異性IgM和IgG陽(yáng)性）確診；②年齡為18～70歲；③入院時(shí)處于HFRS病程急性期。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＜18歲或＞70歲；②入院時(shí)已進(jìn)入HFRS病程的恢復(fù)期；③合并妊娠的女性患者；④合并心血管疾病、糖尿病、血液系統(tǒng)疾病、慢性腎臟疾病、自身免疫性疾病、病毒性肝炎或艾滋病患者。鑒于發(fā)熱期、低血壓休克期和少尿期是HFRS患者疾病進(jìn)展、臟器功能損傷和并發(fā)癥發(fā)生的主要時(shí)期，而且多數(shù)患者在進(jìn)入多尿早期時(shí)，腎功能損傷仍較重，可能伴有腎性腦病、腎破裂等嚴(yán)重并發(fā)癥，因此本研究將急性期界定為發(fā)熱期至多尿期前3病日，恢復(fù)期為多尿中后期和恢復(fù)期[13]。另選取28例健康志愿者作為對(duì)照。依據(jù)HFRS臨床分型標(biāo)準(zhǔn)，將納入的102例患者分為輕型、中型、重型和危重型4組，對(duì)患者人口統(tǒng)計(jì)學(xué)信息及住院期間實(shí)驗(yàn)室檢查數(shù)據(jù)進(jìn)行采集匯總。本研究經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查同意，所有納入患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 標(biāo)本采集與保存 采用無(wú)抗凝劑的干燥管，分別于納入患者病程的急性期和恢復(fù)期各采集1份晨起空腹血標(biāo)本，每份5 ml。標(biāo)本采集后30 min內(nèi)進(jìn)行低溫高速離心（4 ℃，5000 rpm，10 min），分離血清，用500 μl EP管分裝后，凍存于-80℃冰箱中備用。為避免因標(biāo)本反復(fù)凍融影響檢測(cè)結(jié)果，以及檢測(cè)過(guò)程中因不同批次試劑帶來(lái)的誤差，待全部標(biāo)本收集完后一次性解凍，成批檢測(cè)。

1.3 FRT檢測(cè) 采用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定標(biāo)本中的FRT含量，所使用的試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司且為同一批號(hào)。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度（optical density,OD）值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)各樣本OD值計(jì)算出相應(yīng)FRT含量。每個(gè)樣本均設(shè)復(fù)孔，取平均值作為該樣本的FRT含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 分別用SPSS 23.0和GraphPad Prism 8進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和圖表繪制。對(duì)符合正態(tài)分布且各組間方差齊同的資料用±s表示，組間總體比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)。對(duì)不符合正態(tài)分布或組間方差不齊的資料用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，用非參數(shù)Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)比較總體差異，用Nemenyi秩和檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，兩配對(duì)樣本比較采用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)（率）表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。急性期FRT與常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性用Spearman秩相關(guān)分析。應(yīng)用Logistic回歸分析構(gòu)建基于急性期FRT和常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的HFRS預(yù)后（死亡）風(fēng)險(xiǎn)模型，并用ROC曲線評(píng)估模型、FRT和常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)對(duì)HFRS預(yù)后（死亡）預(yù)測(cè)的價(jià)值。雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基線資料 102例HFRS患者中，男性81例，女性21例，平均年齡為42.15歲。其中輕型組17例、中型組19例、重型組27例、危重型組39例，危重型患者中有18例在急性期死亡。各型患者與對(duì)照組之間的性別、年齡分布，以及各型急性期采血時(shí)間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）（表1）。

表1 HFRS患者及健康對(duì)照者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)特征Table 1 Demographic characteristics of patients with HFRS and healthy controls

2.2 HFRS患者血清FRT水平比較 各型HFRS患者急性期血清FRT水平均高于同型恢復(fù)期和對(duì)照組（P均＜0.05），且隨著病情加重，F(xiàn)RT水平逐漸增高，在危重型患者中表達(dá)最高（P＜0.05）。各型患者恢復(fù)期血清FRT水平均高于對(duì)照組（P均＜0.05），但各型間表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖1）。

圖1 HFRS患者血清FRT水平比較A.各組急性期靜脈血標(biāo)本量：輕型n=17，中型n=19，重型n=27，危重型n=39，對(duì)照組n=28；各型患者急性期血清FRT水平比較，H=71.734，P=0.000。B.各組恢復(fù)期靜脈血標(biāo)本量：輕型n=13，中型n=15，重型n=25，危重型n=21，對(duì)照組n=28；各型患者恢復(fù)期血清FRT水平比較，H=33.074，P=0.000。C.各型患者急性期血清FRT水平與同型恢復(fù)期對(duì)比：輕型組，Z=-3.180，P=0.001；中型組，Z=-3.296，P=0.001；重型組，Z=-4.372，P=0.000；危重型組，Z=-4.015，P=0.000。Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)比較多組間總體差異。Nemenyi秩和檢驗(yàn)進(jìn)行多組間兩兩比較。兩配對(duì)樣本比較采用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)。＊.P＜0.05Figure 1 Comparison of serum FRT levels in patients with HFRS

2.3 FRT與常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析顯示，HFRS患者急性期血清FRT水平與WBC、PLT、AST、APTT等常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)均具有相關(guān)性。其中與PLT相關(guān)性最強(qiáng)（rs=-0.792，P=0.000）（表2，圖2）。

圖2 FRT與WBC、PLT、ALB、AST、APTT、Fib的相關(guān)性Figure 2 Correlation analysis between FRT and WBC,PLT,ALB,AST,APTT,Fib

表2 FRT與常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between FRT and conventional laboratory parameters

2.4 HFRS預(yù)后（死亡）風(fēng)險(xiǎn)模型構(gòu)建及ROC曲線分析 納入HFRS患者急性期FRT及常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)（WBC、PLT、HGB、ALB、ALT、AST、PT、APTT、Fib、BUN、SCr、K+、Na+），應(yīng)用Logistic回歸分析構(gòu)建HFRS預(yù)后（死亡）風(fēng)險(xiǎn)模型，最終進(jìn)入模型的指標(biāo)為WBC、AST和APTT（表3）。

表3 Logistic回歸分析構(gòu)建HFRS預(yù)后（死亡）風(fēng)險(xiǎn)模型*Table 3 Prognostic (death) risk model* in patients with HFRS constructed by Logistic regression analysis

應(yīng)用ROC曲線分析評(píng)估模型對(duì)HFRS患者預(yù)后（死亡）的預(yù)測(cè)價(jià)值，AUC為0.936（95%CI：0.867～1.000，P=0.000），敏感度為94.4%，特異度為59.0%，模型預(yù)測(cè)預(yù)后（死亡）的價(jià)值高于FRT、WBC、PLT和AST等單個(gè)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)（表4，圖3）。

圖3 ROC曲線分析模型及單個(gè)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)預(yù)測(cè)預(yù)后（死亡）的價(jià)值Figure 3 ROC curves for evaluating the predictive values of prognostic risk model and single laboratory parameter

表4 預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型及單個(gè)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)預(yù)測(cè)預(yù)后（死亡）的價(jià)值比較Table 4 Comparison of predictive values for prognosis (death) between the prognostic risk model and single laboratory parameter

3 討 論

HFRS是由漢坦病毒感染引起的一種自然疫源性疾病，我國(guó)一直是HFRS流行的重災(zāi)區(qū)，特別是陜西省關(guān)中地區(qū)，以漢坦型病毒感染引起的重癥患者居多，死亡率較高[14]。HFRS具有全身炎癥反應(yīng)綜合征的病理生理特征，病毒感染后可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞受損，血管通透性增加，重癥患者甚至出現(xiàn)“毛細(xì)血管滲漏綜合征”[15-16]。HFRS的臨床表現(xiàn)以發(fā)熱、出血及腎臟損害為主要特征，典型病例通常有發(fā)熱、低血壓休克、少尿、多尿和恢復(fù)期五期經(jīng)過(guò)[17]。在某些重癥患者中，發(fā)熱、低血壓休克和少尿期可能重疊，進(jìn)而出現(xiàn)難治性休克、急性呼吸窘迫綜合征、急性腎損傷、腦病、嚴(yán)重凝血功能障礙和多器官功能障礙綜合征[18]。雖然國(guó)內(nèi)早在二十世紀(jì)80年代制定了HFRS的臨床分型標(biāo)準(zhǔn)，其在該病防治中起到了十分重要的作用，但由于該分型標(biāo)準(zhǔn)中多數(shù)指標(biāo)均建立在患者主觀癥狀和醫(yī)生體檢的基礎(chǔ)上，大多數(shù)參數(shù)未能量化，因此難以早期評(píng)估患者病情及預(yù)測(cè)預(yù)后，使用上具有一定局限性。近年來(lái)，亦有部分研究探索了一些可反映HFRS疾病嚴(yán)重程度和預(yù)測(cè)患者預(yù)后的早期預(yù)警指標(biāo)，如白細(xì)胞介素-18、脂聯(lián)素、生長(zhǎng)抑制特異性蛋白-6、尿中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白等[19-21]。但是以上指標(biāo)由于檢測(cè)成本較高，操作方法復(fù)雜，而且預(yù)測(cè)效力不高，因此尚未推廣應(yīng)用至臨床。

在本研究中，我們檢測(cè)了HFRS患者血清FRT水平變化，發(fā)現(xiàn)急性期FRT濃度較同型恢復(fù)期和健康對(duì)照明顯升高，且與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，在危重型患者中表達(dá)最高。FRT作為一種評(píng)價(jià)機(jī)體炎性狀態(tài)和氧化應(yīng)激的指標(biāo)，該結(jié)果反映了漢坦病毒感染后機(jī)體超強(qiáng)的免疫反應(yīng)所致的“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，這與FRT在膿毒癥、埃博拉出血熱和克里米亞-剛果出血熱患者中的研究結(jié)果相一致[8-11]。漢坦病毒侵入機(jī)體后，引起機(jī)體過(guò)度的炎癥反應(yīng)，大量炎癥因子釋放可能誘導(dǎo)肝細(xì)胞合成并釋放FRT。同時(shí)，HFRS患者WBC升高，中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞在抗炎吞噬過(guò)程中可大量合成并釋放FRT，進(jìn)而引起血清FRT水平升高。此外，重癥HFRS患者肝細(xì)胞受損導(dǎo)致大量FRT釋放入血可能也是其急性期血清FRT水平升高的機(jī)制之一。

本研究還發(fā)現(xiàn)HFRS患者血清FRT水平與WBC、PLT、AST和APTT等指標(biāo)密切相關(guān)。WBC是機(jī)體固有免疫充分活化的標(biāo)志，PLT與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度密切相關(guān)，AST、APTT分別反映了患者心臟和凝血系統(tǒng)的受損程度。這表明急性期血清FRT水平與HFRS疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。ROC曲線分析顯示，F(xiàn)RT預(yù)測(cè)HFRS預(yù)后（死亡）的敏感度和特異度均較高，其預(yù)測(cè)價(jià)值與WBC、PLT、AST、APTT等常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)相當(dāng)。因此，F(xiàn)RT可用于評(píng)估HFRS患者病情，并預(yù)測(cè)患者預(yù)后。

FRT是目前臨床工作中實(shí)際開(kāi)展的檢查項(xiàng)目，其檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，操作方便，價(jià)格低廉。但因不同疾病甚至同一疾病不同病程的FRT水平變化較大，部分醫(yī)院在檢測(cè)時(shí)僅按說(shuō)明書(shū)操作，在檢測(cè)到＞2000 μg/L以后便不再進(jìn)一步稀釋，且大多數(shù)醫(yī)院主要將其作為腫瘤標(biāo)志物而用于早癌篩查，這些因素均限制了FRT在臨床診療中的應(yīng)用。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)RT在重癥HFRS早期預(yù)警及預(yù)后評(píng)估中具有重要價(jià)值，可進(jìn)一步推廣普及此項(xiàng)檢測(cè)，建議將其作為HFRS的一項(xiàng)常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。當(dāng)然，考慮到不同分型、不同病期HFRS炎癥反應(yīng)程度不同，需要對(duì)采集的血樣本進(jìn)行合理地稀釋，以得到更為準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，這樣才能真正發(fā)揮FRT在重癥HFRS早期預(yù)警及預(yù)后評(píng)估中的作用。

本研究中Logistic回歸分析所構(gòu)建的預(yù)后（死亡）風(fēng)險(xiǎn)模型表明，聯(lián)合多個(gè)指標(biāo)對(duì)HFRS患者預(yù)后進(jìn)行評(píng)估，其預(yù)測(cè)效力明顯高于單個(gè)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。但該模型最終納入的3個(gè)指標(biāo)為WBC、AST和APTT，F(xiàn)RT未能進(jìn)入模型。因此，未來(lái)需要擴(kuò)大樣本，采取多中心、前瞻性研究，進(jìn)一步深入探索并驗(yàn)證包括FRT在內(nèi)的新的重癥HFRS早期預(yù)警指標(biāo)，對(duì)現(xiàn)有的影像學(xué)檢查、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和重癥監(jiān)護(hù)數(shù)據(jù)進(jìn)行有效整合和分析，構(gòu)建基于新型生物標(biāo)志物、臨床參數(shù)和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型，制定HFRS重癥評(píng)分系統(tǒng)及新的臨床分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，以早期動(dòng)態(tài)評(píng)估HFRS患者病情變化并預(yù)測(cè)患者預(yù)后，這對(duì)指導(dǎo)臨床醫(yī)生及時(shí)調(diào)整治療方案，提高重癥患者救治成功率、改善患者預(yù)后具有重要意義。