骨髓間充質干細胞在體分子影像示蹤技術的研究進展

李天然（綜述） 盧光明（審校）

（1.解放軍總醫院第四醫學中心放射診斷科，北京 100048；2.解放軍東部戰區總醫院放射診斷科，江蘇 南京 21000）

基于自體骨髓間充質干細胞（BMSCs）的生物治療是多種疾病最有潛力的治療方法[1-2]。BMSCs移植后，在體BMSCs轉歸的監測，即移植后BMSCs的分布、活性、分化、凋亡情況的監測，一直是干細胞研究的重要方向[3-4]。采用組織病理學觀察的方法進行移植BMSCs監測需要離體進行，屬于有創檢測技術[5]。利用現代多模態分子影像學技術可實現對BMSCs在體、實時命運轉歸的示蹤監測，能夠無創顯示BMSCs可能的演進方向[6-7]。移植BMSCs的在體影像監測包括兩個方面：一是BMSCs在體遷移、分布、定位的示蹤；二是在體BMSCs分化的示蹤。現將有關BMSCs分子影像學示蹤技術的研究進展綜述如下。

1 移植 BMSCs在體遷移、分布、定位的示蹤技術

對于移植BMSCs在體遷移、分布、定位的監測，從實現技術上分為光學成像、核磁共振成像（MRI）、正電子成像（PET）和單光子成像（SPECT）；從實現方式上主要分為對BMSCs進行直接標記和間接標記兩種方法。

1.1 直接標記法 一種方法是利用超順磁性氧化鐵納米顆粒（superparamagnetic iron oxide，SPIO）對BMSCs進行標記，通過MRI移植觀察干細胞在腫瘤組織中的定位、遷移及分布。SPIO標記BMSCs主要有兩種方法：一是將SPIO吸附于BMSCs表面，但網狀內皮系統會清除SPIO標記的細胞；二是細胞將SPIO通過直接吞飲作用、受體介導胞吞作用、轉染介導實現示蹤劑內在化[8-9]。商品名為菲立磁的SPIO是被美國FDA批準上市的用于臨床MRI成像的示蹤劑。SPIO標記屬于外源性鐵直接標記MRI成像。有學者利用SPIO標記干細胞在體治療軟骨缺損病，在不同時間點行3.0 T MRI掃描，計算T2值作為定量指標，同時利用影像評分法觀察軟骨組織修復情況，結果顯示，SPIO標記技術有助于利用MRI早期判斷干細胞治療大型動物模型軟骨缺損是否成功[10]。SPIO具有粒徑小、穿透力強、磁標時間長的特點，移植后至少在18周內可檢測到磁標細胞，且弛豫率約為同樣條件下釓離子（Gd3+）的7～10倍, 在很低濃度(nmol級)即可在MRI上形成對比，最主要的是，經SPIO標記后的BMSCs不改變特性，SPIO對BMSCs無毒性作用、可降解，并且改變粒徑可以改變磁性[11]。甚至有研究表明，SPIO標記對干細胞的生長及其組織修復功能都有增強作用，低強度靜磁場可以增強SPIO協助促進的成骨分化效應[12]。SPIO主要縮短T2時間，T2信號減低，與周圍組織形成良好對比，即使低濃度也能成像[13]。SPIO磁標細胞的缺點有：①顆粒會導致信號丟失而產生“黑洞”；②鐵因干細胞的增生分裂而被稀釋，使得磁標記的強度下降，因而MRI測定的敏感性降低；③標記細胞死亡后可釋放含鐵標記物，可能會將周圍未標記的細胞標記從而產生假陽性[14-15]。

直接標記移植BMSCs的另一個方法是熒光成像技術。熒光成像技術中碳量子點（carbon quantum dots，CQDs）技術在生物成像領域的應用已得到拓展。CQDs表面有豐富的羧基基團，通過偶聯作用可以實現與SPIO結合，通過吞飲作用進入BMSCs內，實現穩定標記，且不改變BMSCs的理化性質，并具有通過不同波長的熒光激發實現多顏色熒光成像的優勢[16-17]。

1.2 間接標記法 間接標記法主要利用BMSCs是基因良好載體這一特性，有學者指出，BMSCs是基因治療中理想的載體細胞，在BMSCs移植前，將多種外源性目的基因整合至BMSCs基因組中，BMSCs不僅能穩定轉染和表達外源性基因，而且能夠定向分化，修補受損的組織[18]。對BMSCs進行基因修飾，使之攜帶分子影像探針基因，可以實現對其示蹤。有學者對BMSCs進行跨膜蛋白-鐵轉運蛋白基因轉染，使之高表達鐵轉運蛋白，該蛋白具有聚集鐵離子的能力，從而產生內源性鐵-MRI信號成像，實現對BMSCs的示蹤，其優點在于使用內源性鐵離子成像，無需外源性探針標記，且內源性鐵離子表達穩定；缺點是伴隨鐵離子集聚會增加活性氧含量，破壞細胞結構，這成為阻礙在臨床上開展成像示蹤的原因，并且，隨著細胞的分裂，信號會丟失[19-20]。雖然如此，間接標記法仍優于直接標記，因其更能體現BMSCs的活力狀態以及提供更多的細胞功能信息。另有作者將鐵蛋白重鏈（FTH）和轉鐵蛋白受體（TfR）兩個報告基因同時轉染BMSCs對BMSCs進行示蹤，進行體外小動物MRI成像，結果顯示報告基因能夠為MRI成像提供足夠的信號強度，能夠在體內對BMSCs的遷移和分布進行MRI示蹤，并且研究發現，經報告基因轉染的BMSCs不影響BMSCs的生物學特性[21]，這為開展基于內源性鐵MRI成像示蹤開辟了新途徑。還有研究者將跨膜蛋白碘化鈉轉運體（NIS）的基因導入BMSCs內并行正電子核素124I標記，將BMSCs細胞移植至肝癌組織中，可以通過124I-PET 監測BMSCs在肝癌組織中的活動情況，且NIS不改變BMSCs的理化性質，其另一優點是124I半衰期（半衰期4.2 d）較長，適合較長時間反復觀察[22-23]。

直接標記和間接標記示蹤移植干細胞都有缺點，因此，基于BMSCs是基因良好載體這一特性，構建穩定表達、不改變BMSCs生物學特性、易于標記的多模態分子影像探針，結合直接標記和間接標記的優點，解決BMSCs轉歸的在體、實時分子影像監測問題是現代干細胞治療的課題之一。多模態分子影像探針解決了多分子探針重復成像的弊端，還可通過基因轉染實現穩定表達和標記，適合長期反復使用。

2 移植BMSCs在體分化的示蹤技術

通過以上所述的示蹤技術，能夠實現體內外BMSCs的遷移、分布、定位的多模態分子影像學監測。然而，在動物模型上的活體BMSCs分化示蹤由于受到某些因素如成像所需分化細胞數量級別、差異性分子影像探針構建和成像設備分辨率等的限制而進展緩慢，而對BMSCs在體分化進行示蹤監測更有價值和研究意義，可以實現追蹤BMSCs在特定微環境下定向誘導分化的去向。因此，BMSCs分化轉歸的在體示蹤技術受到關注。BMSCs分化示蹤可以分為細胞學水平示蹤和動物模型水平示蹤兩個層次。要完成BMSCs分化轉歸的示蹤，必須借助分子生物學研究的最新技術。

2.1 報告基因BMSCs成像 典型的報告基因成像技術是熒光蛋白成像，熒光蛋白成像目前多限于基礎生物學研究。熒光蛋白基因通過病毒和質粒等載體與目的蛋白基因整合后，可以在宿主細胞內表達并在激發光照射下發出熒光。在體小動物報告基因成像原理是，BMSCs在特定微環境誘導下的定向分化過程中，會有某些特異性生物活性因子的表達，利用其中某種特異性生物活性因子基因作為目的基因，利用該目的基因表達的特異性活性蛋白（或因子）作為啟動子驅動MRI報告基因表達，可實現通過MRI報告基因成像監測BMSCs的定向分化；反之，當組織中出現某些特異性生物活性因子表達升高時可以說明BMSCs的分化狀態及其特定分化方向，因此將某種特異性生物活性因子基因作為啟動子基因就可以實現BMSCs特定方向分化的示蹤，基于磁性物質內源性鐵MRI成像成為研究的首選報告基因。有研究者通過構建神經元特異性烯醇化酶（NSE）啟動子驅動FTH1基因表達的慢病毒（NSE-FTH1）載體并轉染BMSCs，并將轉基因BMSCs誘導分化為神經元樣細胞，檢測其FTH1的表達及MRI信號變化，研究NSE啟動子驅動FTH1基因表達的變化并利用MRI成像監測BMSCs向神經細胞分化的可行性，結果顯示，NSE啟動子在BMSCs向神經細胞分化的過程中能特異性地啟動報告基因FTH1表達，并且MRI信號也發生改變，作者認為基于NSE啟動子報告基因內源性鐵MRI成像可用于BMSCs向神經細胞分化的監測[24]。可見，通過基因轉染技術實現BMSCs內源性鐵MRI成像是可以實現的，但特異性高表達基因的啟動子的尋找是實現BMSCs定向分化過程中分化示蹤的關鍵。

2.2 調控表達報告基因BMSCs內源性鐵MRI成像 報告基因成像技術雖然可以實現BMSCs定向分化示蹤，但是這時的BMSCs分化是人為啟動的、非正常BMSCs生理狀態下、非自然發生的，人為干預可能改變BMSCs的生物學行為。有研究采用四環素誘導Tet-On/Tet-Off基因表達調控系統，攜帶自殺基因治療間變型甲狀腺癌，取得良好的效果[25]。利用這個思路，可利用四環素衍生物強力霉素作為通用誘導啟動子調控跨膜蛋白如NIS或TfR、FTH目的基因的表達, 且可以有效調控基因表達的時間和水平[26-28]，即當BMSCs在特定微環境下發生定向分化時啟動目的基因的表達，實現BMSCs分化示蹤。因此可以進行如下設計：可以將NIS和TfR、FTH基因整合到Tet-On/Tet-Off基因表達調控系統中作為載體，基因轉染BMSCs，通過強力霉素作為誘導啟動子，在BMSCs開始分化的時間段內開啟NIS或TfR基因的表達，并進行多模態分子影像成像，通過對成像規律的總結與分子生物學結果的互證實現對BMSCs分化的在體示蹤監測。但BMSCs體外細胞學容易觀察到定向分化時間，而在體動物模型或人體中難以準確觀察到定向分化時間。這就需要用到篩選BMSCs定向分化最終細胞與BMSCs的分子生物標志物的差異技術。

2.3 自動調控表達報告基因BMSCs內源性鐵MRI成像 采用荷肝癌鼠血清作為誘導刺激培養基，體外誘導培養BMSCs，miRNA 微陣列技術分析BMSCs表達譜的差異，篩選差異最顯著的miRNA，將顯著變化的miRNAs輸入miRNA數據庫進行下游目的基因的預測。在體動物模型根據該目的基因表達相應蛋白水平將其作為指示因子（非啟動子），啟動Tet-On/Tet-Off基因表達調控系統實現靶基因（如NIS和TfR、FTH）表達[29]，進行在體分子影像學BMSCs示蹤成像。更進一步設計，并在此基礎上，探索設計特異性啟動子（specific promoter），當目的基因表達出現差異時，該特異性啟動子啟動靶基因（如NIS或TfR、FTH）的表達，進行MRI分子影像學成像，觀察成像規律，實現在體BMSCs定向分化的在體示蹤。

雖然通過這種設計，理論上可以實現BMSCs的分化的自動示蹤，但也存在諸多問題，比如BMSCs內轉染多種生物活性因子后，對BMSCs的定向分化是否會有影響？對干細胞的生物活性是否存在影響？由此可見，實現BMSCs的在體分化示蹤需要多種生物技術進行合力攻關。

目前，BMSCs遷移、分布、定位的在體示蹤技術通過合適的標記技術基本可以實現，尤其是通過基因修飾實現多模態分子影像成像成為可能。相比較而言，BMSCs分化的在體多模態分子影像示蹤技術實現較為困難，主要與靶分子的標記、分化后的降解、設備的分辨率有關，但通過多種生物學技術的合理應用將有望實現BMSCs在體分化的多模態分子影像示蹤。設計簡單易行、特異性強、靈敏度高、細胞毒性低、受外界干擾小以及移植干細胞的長期定量等優點的內、外源分子影像探針是科研攻關的目標。