“大紅袍揮發油中檸檬烯含量測定”簡化實驗教學*

解子儀 劉芯瑩 寧安琪 逯佩玉 邵亞洲 梁俊玉

（西北師范大學生命科學學院 甘肅蘭州 730070）

大紅袍（Zanthoxylum bungeanumMaxim）為花椒屬植物的一種，揮發油含量豐富[1]。大紅袍揮發油中存在一種主要成分——檸檬烯（limonene），氣味類似檸檬的香味，功能眾多，包括抗菌抑菌、殺蟲殺螨、防腐保鮮等。檸檬烯在食品藥品、日化領域應用廣泛[2-3]。本實驗以甘肅省隴南市產的大紅袍為材料，提取大紅袍揮發油，測定揮發油中檸檬烯的百分含量。通過分析實驗難點，調整實驗方案，使實驗各個操作環節安全可控，學生只要以嚴謹的科學態度，認真仔細操作每一步驟，易獲得可靠結果，適合作為中職院校的生物學實驗教學。

1 探究實驗難點

在實驗目的上，多數文獻為探究檸檬烯在大紅袍中的百分含量。以文獻《基于GC-MS技術對甘肅隴南大紅花椒揮發油檸檬烯芳樟醇含量的測定》和《花椒揮發油的提取及其抑菌抗蟲活性測定》為例[4-5]。實驗內容存在難點：1）需選用不同溶劑提取大紅袍揮發油，并比較揮發油顏色、狀態、氣味；2）分別計算大紅袍揮發油的提取率；3）選擇呈黃色透明油狀有單純花椒氣味，且提取率高的溶劑進行實驗。但由于中職學生較難把握判斷標準，且實驗時間有限，故實驗不易于實施。

2 簡化方案及效果

筆者嘗試調整實驗思路，明確實驗目的為“探究檸檬烯在大紅袍揮發油中的百分含量”。學生只需完成3個環節，即大紅袍揮發油的提取、氣質聯用儀測定檸檬烯含量、歸一化法確定檸檬烯百分含量。首先，測定檸檬烯的含量是相對揮發油的含量而言，無需計算大紅袍的提油率；其次，采用水蒸氣蒸餾法提取大紅袍揮發油，不涉及對多種提取溶劑的比較。簡化后的實驗要求，符合中職學生的實際操作能力，易于在生物學實驗課堂實施。

2.1 實驗目的 通過查閱資料，展開合作探究性學習，使學生理解提取揮發油的原理，掌握提取揮發油的操作方法和注意事項；學會使用氣質聯用儀等實驗設備；并對實驗課堂產生興趣，對大紅袍有效成分的藥用價值產生研究熱情。

2.2 實驗材料與儀器

1）試劑：乙醚、正己烷、檸檬烯標準品（20 mg）、蒸餾水。

2）儀器：氣質聯用儀、微孔濾膜、20 目分選篩子、粉碎機、濾紙、揮發油提取器、圓底燒瓶、錐形瓶、容量瓶、冷凝管、紗布、沸石、電熱套。

3）材料準備：選用產自甘肅隴南的大紅袍干燥的果皮。稱取大紅袍樣品100 g 粉碎，過20 目篩，裝入2 000 mL 的圓底燒瓶中，加800 mL 蒸餾水及沸石，浸泡過夜。

2.3 實驗流程

1）標準品制備[6]：精密稱取20 mg 檸檬烯，置于5 mL容量瓶中，用正己烷定容，即得檸檬烯標準品。

2）揮發油提取：如圖1所示，搭建提取揮發油裝置。在揮發油測定器中加入蒸餾水至溢流入圓底燒瓶中，電熱套上加熱圓底燒瓶，溫度為120℃，蒸餾4 h，冷卻。從揮發油測定器中放出所提取的大紅袍揮發油，轉移至分液漏斗，加少許乙醚萃取并過濾，常溫下揮干乙醚，得芳香油，為黃色且有特殊香味。取揮發油30 μL，加正己烷定容至10 mL，再用微孔濾膜過濾，即得檸檬烯供試品[7]。

圖1 大紅袍揮發油提取裝置

3）氣質聯用儀測定[8]：①測定前：設置氦氣壓力為0.5 MPa，流速為1.0 mL/min。②測定時：色譜條件，初始溫度60℃，程序升溫，從10℃/min 速率升至180℃；待1 min 后，以20℃/min 升至280℃，保持5 min；進樣量1 μL（用正己烷稀釋至1%），分流比為10∶1 進樣；汽化室溫度為250℃；質譜條件，電壓70 eV，溫度230℃; 掃描范圍20～200 m/z。③測定后：數據比較NIST 和WILEY 庫及文獻中記錄的化合物進行鑒定，得出檸檬烯的含量。

4）標準曲線制備：精密吸取上述對照品母液加正己烷稀釋，得系列濃度梯度。按上述色譜條件分別進樣，以進樣量對峰面積積分值進行回歸處理，得檸檬烯標準曲線。檸檬烯回歸方程為y=（5×108）x-2×107，R2=0.9996。

2.4 實驗結果與分析 本次實驗將20 人分為3 組進行實驗，實驗結果均較好且差異不大，以其中一組數據進行分析。圖2為大紅袍揮發油TIC（total ions chromatograph）,即總離子流圖，由圖可知，大紅袍揮發油的分離正確；圖3和圖4為質譜與NIST 和WILEY 對照，通過與檸檬烯標準品對照，確定大紅袍揮發油中含有檸檬烯的成分。

圖2 大紅袍揮發油總離子流圖

圖3 檸檬烯標準品質譜圖

圖4 檸檬烯樣品質譜圖

表1為3 個小組的數據匯總，通過歸一化法，根據氣相色譜峰面積，確定檸檬烯在揮發油中的含量。從計算的數據分析，3 組學生操作得當。最終的實驗結果為，甘肅隴南大紅袍揮發油中檸檬烯含量為24.95%。

表1 大紅袍揮發油中檸檬烯的含量

2.5 實驗注意事項

1）揮發油提取：電熱套接觸的玻璃器皿應保持干燥，否則電熱套易短路；冷凝水流速適中，以不燙手為原則；冷凝管要“下管進水、上管出水”。

2）檸檬烯測定：注射器每次進樣后要及時清洗，并擦干針頭；進樣保持進針豎直，進入后快進快出。

3 反思

3.1 注重學生現有實驗水平，合理設計實驗方案實驗的順利進行，依靠教師對實驗方案的精心設計，而學生現有的實驗水平，則是教師展開教學設計的基礎。目前，中職學生操作的獨立性和實踐的創新性不強，實驗基礎較薄弱。據此，本實驗調整實驗思路，明確“探究檸檬烯占大紅袍揮發油的百分含量”為實驗目的，精減實驗內容，減少操作環節，適合學生以合作探究的方式完成實驗，增強學習興趣與信心。

3.2 教師適時引導，培養學生思考能力 思考能力與實驗能力密切相關，做實驗應手腦并用，不假思索的機械操作將無法提高實驗水平，思考能力制約著學生實驗水平的發展，在實驗教學中“如何培養學生的獨立思考能力”是每一位生物學教師必須思考的問題。本實驗中，教師多次提出問題，引導學生思考，鼓勵學生自己找尋答案，例如，在提取大紅袍揮發油時，教師展示2 種揮發油提取裝置，并提問哪個裝置適于本實驗？由學生思考后給出答案，教師再針對學生回答情況進行總結，逐步培養學生獨立思考的習慣。

3.3 培養學生科學素養，提升實驗教學價值 生物學實驗教學具有直觀性、實踐性和激發性，是培養學生科學素養的重要環節之一。實驗前，學生能直觀感受大紅袍的結構特征，以此豐富感性知識；實驗過程中，學生親身實踐，鍛煉自身實驗操作能力；實驗后，通過對實驗數據的分析，學生了解大紅袍所具有的研究價值，進而激發學生對植物源中單體成分的研究興趣，提高動手能力和解決問題的能力，培養學生的生物學科學素養。