綠豆發(fā)芽對(duì)其抗氧化作用的影響

邱彥超，李 琳，錢麗麗,2,3?，李殿威，符麗雪

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江省雜糧加工及質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319；3.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 大慶 163319）

綠豆?fàn)I養(yǎng)豐富，是食品工業(yè)的重要原料[1]。綠豆在發(fā)芽過程中，黃酮和酚類物質(zhì)被釋放出來[2]，增加抗氧化能力，維生素類的物質(zhì)含量也會(huì)大幅增加[3-5]。黃酮類化合物具有抗腫瘤、延緩衰老等作用[6-7]。黃酮和多酚在許多提取物中表現(xiàn)出較好的抗氧化能力[8]。

Swiecam 等[9]在研究發(fā)芽時(shí)間和光照條件對(duì)扁豆豆芽抗氧化化合物和抗氧化能力的影響中發(fā)現(xiàn)，在萌發(fā)后3～4 d，水楊酸、p-羥基苯甲酸、咖啡酸含量有大幅增加。黃六容[10]等在研究發(fā)芽溫度對(duì)綠豆芽抗氧化成分和抗氧化能力的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)在 30 ℃下培育綠豆芽能獲取最大的產(chǎn)量，但只在 20 ℃下培育綠豆芽才能獲取最高的抗氧化性。郭鴿等[11]對(duì)4種大豆在發(fā)芽過程中的DPPH清除率及總酚和黃酮類物質(zhì)進(jìn)行含量測定，分析結(jié)果表明總酚含量與抗氧化能力呈現(xiàn)正相關(guān)，黃酮類物質(zhì)含量也有明顯的增加。自20世紀(jì)60年代初至今，人們不斷從綠豆及其萌芽中尋找生物活性物質(zhì)[12-13]，從綠豆中分離純化出了許多活性成分，并對(duì)其進(jìn)行功能性分析。

日常生活中，人們受環(huán)境、紫外線等各方面影響，體內(nèi)會(huì)催生出大量的自由基，破壞人體抗氧化系統(tǒng)的平衡，威脅人們的健康[14-15]。所以本實(shí)驗(yàn)從綠色健康的角度出發(fā)，在參考綠豆發(fā)芽最適溫度，加水量條件后[16]，通過對(duì)綠豆萌發(fā)過程中抗氧化成分及抗氧化能力變化進(jìn)行研究，以期為綠豆發(fā)芽產(chǎn)品保留豐富的營養(yǎng)及功能活性物質(zhì)做支持。

1 材料與方法

1.1 原料

綠豆，明綠2號(hào)：2018年采摘自黑龍江省齊齊哈爾市泰來縣。

1.2 主要設(shè)備與試劑

751型分光光度儀：上海儀電分析儀器有限公司；RH-600A型高速多功能粉碎機(jī)：浙江榮浩工貿(mào)有限公司；CB-A323B型發(fā)芽機(jī)：九陽股份有限公司。

蘆丁，純度≥94.47%：成都普思生物科技有限公司；沒食子酸對(duì)照品，純度≥98%：上海源葉生物科技有限公司；草酸，分析純：天津市大茂化學(xué)試劑廠；福林酚試劑（Folin-Ciocalteau）：sigma公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 綠豆芽制備

挑選無破損的優(yōu)質(zhì)綠豆進(jìn)行沖洗、浸泡放入豆芽機(jī)中，20 ℃恒溫培養(yǎng)萌發(fā)，制得豆芽備用。

1.3.2 待測樣品制備

連續(xù)6 d，每天同一時(shí)間，準(zhǔn)確稱取25 g萌發(fā)的綠豆芽，置于250 mL燒杯中，攪碎5 min，打漿，取3 g定容于50 mL 60%丙酮水溶液，超聲波提取1 h，6 000 g離心10 min，取上清液，分別進(jìn)行總黃酮、總多酚含量及總還原性、–OH清除率、DPPH清除率及VC含量測定。

1.3.3 總酚含量測定

采用 Folin-Ciocalteau法[17]取上述提取液5 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定總酚含量。

測定三組平行數(shù)據(jù)，計(jì)算平均值，按下述公式1計(jì)算總酚含量。

式中：X—試樣中總酚含量，單位為毫克每克（mg/g）；A—測定用樣液中沒食子酸的濃度，單位為毫克每毫升（mg/mL）；m—試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；V—試樣處理液總體積，單位為毫升（mL）。

1.3.4 黃酮含量測定

參照文獻(xiàn)[18]NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法。和略作改進(jìn)文獻(xiàn)[19]取1.3.1節(jié)提取液5 mL， 按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定總酚含量。

測定三組平行數(shù)據(jù)，計(jì)算平均值。根據(jù)計(jì)算下列公式2進(jìn)行黃酮含量測定。

式中：X—試樣中黃酮的含量（以蘆丁計(jì)），單位（mg/g或 mg/mL）；A—測定用樣液中蘆丁的質(zhì)量，單位為毫克（mg）；m—試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；V1—測定用樣液體積，單位為毫升（mL）；V2—試樣處理液總體積，單位為毫升（mL）。

1.3.5 Vc含量測定

取1.3.1節(jié)中的提取液 5 mL，參照國標(biāo) GB 5009.86—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中抗壞血酸的測定》中第3法，進(jìn)行VC含量測定。

1.3.6 總還原能力測定

參照Benzie的方法[20]。取上述提取液5 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定總還原能力。

1.3.7 DPPH清除率測定

參考文獻(xiàn)[21]配制0.2 mmol/L DPPH無水乙醇溶液，取1.3.1節(jié)中的提取液5 mL，測定在517 nm處的吸光值，使用下面公式3對(duì)DPPH清除率進(jìn)行計(jì)算。

表1 DPPH自由基清除率測定Table 1 DPPH free radical clearance rate determination mL

1.3.8 –OH清除率測定

測定方法：取1.3.1節(jié)中的提取液5 mL，取3支試管按下表依次添加9 mmol/L的FeSO4，樣液和0.5%的H2O2等試劑，振蕩混勻，室溫條件下靜置10 min后依次加入9 mmol/L的水楊酸–乙醇，振蕩混勻。用蒸餾水作對(duì)照液，25 ℃水浴30 min，測定在510 nm處的吸光值，使用公式4對(duì)–OH清除率進(jìn)行計(jì)算。

表2 –OH清除率測定Table 2 Determination of –OH clearance rate mL

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 22.0軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=4.06X–0.057 8，R2=0.999 0（n=5）。試驗(yàn)結(jié)果表明，在0.01～0.18 mg/mL內(nèi)，沒食子酸濃度與吸光值 A有良好的線性關(guān)系。根據(jù)測定樣品的吸光度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中算出沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度，根據(jù)計(jì)算公式得出各提取液中的總酚含量。由圖2標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線為 Y=24.271X–0.016 1，R2=0.995 8（n=6）。試驗(yàn)結(jié)果表明，在0～1 mg/mL范疇內(nèi)，蘆丁含量與吸光值A(chǔ)有良好的線性聯(lián)系。根據(jù)測定樣品的吸光值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中算出蘆丁濃度，根據(jù)計(jì)算公式得出各提取液中黃酮含量。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The duofen standard curve

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The luding standard curve

2.2 不同發(fā)芽時(shí)間抗氧化物質(zhì)含量與抗氧化能力變化研究

發(fā)芽1～6 d總酚、黃酮、Vc含量變化分別見圖3～5，由圖得出發(fā)芽1～6 d總酚和黃酮先增加后降低，Vc含量急劇增加。

圖3 發(fā)芽過程中總酚含量變化Fig.3 Changes of total phenol content during germination

圖4 發(fā)芽過程中黃酮含量變化Fig.4 Changes of flavonoid content during germination

圖5 發(fā)芽過程中Vc含量變化Fig.5 Changes in Vc content during germination

發(fā)芽第4 d多酚含量達(dá)到最高0.723 7 mg/g，發(fā)芽前4 d總酚含量增加28.95%，總體間有明顯差異。綠豆在發(fā)芽過程中，隨著外部形態(tài)的變化，為滿足發(fā)芽需要，其中部分物質(zhì)通過生化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為酚類物質(zhì)。當(dāng)發(fā)芽達(dá)到一定程度（約第 4 d后），綠豆芽形態(tài)變化達(dá)到一定程度，液泡膜受到損傷，液泡中酚類物質(zhì)與多酚氧化酶反應(yīng)，催化酚類物質(zhì)氧化成醌，醌再經(jīng)過聚合作用，不可逆地產(chǎn)生有色物質(zhì)，引起褐變[22]。從而表現(xiàn)為綠豆發(fā)芽過程中多酚含量先增加后降低。

發(fā)芽第3 d黃酮含量達(dá)到最高0.697 4 mg/g，發(fā)芽前3 d黃酮含量增加5.59%。第3 d與第4 d有明顯差異，黃酮含量總體間差異較小。綠豆發(fā)芽過程中黃酮的含量增加與降低與酶的活性相關(guān)，有研究表明[23]黃酮含量與苯丙氨酸解氨酶活性有關(guān)。發(fā)芽前期（1～3 d），苯丙氨酸解氨酶活性較強(qiáng)，催化部分物質(zhì)通過生化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為黃酮物質(zhì)，發(fā)芽后期，酶活性降低，黃酮合成趨于平緩，最后降低。

發(fā)芽1～6 d，Vc增加了89.48%，總體間存在明顯差異。發(fā)芽過程中，淀粉水解產(chǎn)生的葡萄糖為Vc的生物合成提供了原料，因而Vc含量大為增加[12]。隨著發(fā)芽的進(jìn)程，綠豆內(nèi)部 Vc得以釋放，使Vc功能特性也得以增加。另有研究表明[25]，Vc的增加可以誘導(dǎo)G6PDH酶活性增加酚類物質(zhì)含量。

發(fā)芽1～6 d DPPH清除率、–OH清除率、總還原能力變化見圖 6，三種抗氧化能力都表現(xiàn)為先增加后降低。DPPH清除率各數(shù)值間顯著性差異較大，–OH清除率各數(shù)值間均存在顯著性差異，總還原能力6個(gè)樣品之間差異性不大。在發(fā)芽第3 d時(shí)，DPPH清除率、–OH清除率、總還原能力各指標(biāo)最高分別為99.28%、97.00%、79.26%，分別提高了4.68%、1.04%、46.76%。第3 d與第6 d相比，各指標(biāo)均出現(xiàn)較大范圍的數(shù)值變化。

圖6 發(fā)芽過程中抗氧化能力變化Fig.6 Changes in antioxidant capacity during germination

表3 不同發(fā)芽時(shí)間抗氧化物質(zhì)含量與抗氧化能力Table 3 Antioxidant content and antioxidant capacity in different germination times

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[24]，黃酮和酚類物質(zhì)具有較好的自由基清除能力，是近年來天然抗氧化劑研究的熱點(diǎn)之一。因此選用這兩種物質(zhì)含量作為研究綠豆芽最佳食用時(shí)間指標(biāo)，對(duì)人體健康吸收有益物質(zhì)具有重要指導(dǎo)意義。

2.3 綠豆發(fā)芽過程中抗氧化成分與抗氧化能力的相關(guān)性分析

由表4可知，發(fā)芽過程中，總酚與DPPH清除率、–OH清除率之間呈極顯著，相關(guān)系數(shù)分別為0.885和0.768，黃酮與DPPH清除率、–OH清除率相關(guān)系數(shù)分別為0.553和0.518，說明在發(fā)芽過程中主要的抗氧化物質(zhì)為酚類物質(zhì)。Gie等[25]研究表明油桃、桃和李中總酚含量與 FRAP和DPPH抗氧化性高度相關(guān)，與本研究結(jié)果一致。

表4 綠豆發(fā)芽過程中抗氧化成分與抗氧化能力的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis between antioxidant content and antioxidant capacity in green bean germination process %

3 結(jié)論

綠豆發(fā)芽過程中，外部表現(xiàn)為形態(tài)發(fā)生變化，內(nèi)部為一些生化反應(yīng)，這些生化反應(yīng)會(huì)在一段時(shí)間內(nèi)會(huì)產(chǎn)生多種對(duì)人體有益的物質(zhì)，酚類和黃酮物質(zhì)也會(huì)相應(yīng)增加。本研究顯示：綠豆經(jīng)發(fā)芽6 d，總酚和黃酮含量先增加后減少，1～4 d總酚含量增加0.162 5 mg/g，提高28.95%。1～3 d黃酮含量增加0.036 9 mg/g，提高5.59%。另外綠豆本身含有較少的維生素物質(zhì)，發(fā)芽后維生素類的物質(zhì)含量也會(huì)大幅增加。1～3 d，DPPH清除率、–OH清除率、總還原能力各指標(biāo)達(dá)到最高分別為99.28%、97.00%、79.26%，分別提高4.68%、1.04%、46.76%。相關(guān)性結(jié)果表明，抗氧化能力主要與酚類物質(zhì)有關(guān)，因此綜合研究結(jié)果考慮，建議在綠豆發(fā)芽到第4天時(shí)食用，此時(shí)綠豆芽中含有較高的抗氧化物質(zhì)和較高的抗氧化能力，對(duì)人體最有益，該結(jié)論也為綠豆芽食品的開發(fā)提供了支持。