黑芝麻油卵磷脂溶液對(duì)自然生長(zhǎng)老齡小鼠骨代謝的影響

呂思敏，黃志榮，于 瓊，孫金影，崔 燎，吳 鐵,?

（1.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東潤(rùn)和生物科技有限公司輔酶Q10聯(lián)合研究中心，廣東 東莞 523808；2.廣東醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，廣東 東莞 523808；3.廣東醫(yī)科大學(xué) 廣東天然藥物研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524023）

黑芝麻油是從黑芝麻中提煉出來(lái)的，黑芝麻油中富含不飽和脂肪酸——油酸和亞油酸，以及芝麻素、芝麻林素、芝麻酚、維生素E等抗氧化成分[1]。其中，維生素 E能維持細(xì)胞膜的完整性和正常功能，不僅具有顯著的抗氧化、增加免疫、延緩衰老、抗腫瘤及預(yù)防心血管疾病等功能，而且還具有優(yōu)良的促進(jìn)骨形成、抑制骨吸收功效[2]。黑芝麻油中的亞油酸、棕櫚酸等不飽和脂肪酸，容易被人體吸收，有助于消除動(dòng)脈壁上的沉積物，且不飽和脂肪酸在骨質(zhì)疏松治療和預(yù)防中的潛力逐漸顯現(xiàn)[3]。而我們課題組研究發(fā)現(xiàn)[4]，芝麻油在所用劑量下具有預(yù)防醋酸潑尼松致大鼠骨質(zhì)疏松的作用，另外于瓊等[5]研究發(fā)現(xiàn)，3 mL/kg/d的黑芝麻油能良好的對(duì)抗環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的大鼠骨丟失模型中股骨微觀(guān)結(jié)構(gòu)和骨質(zhì)量的退化。為研究黑芝麻油卵磷脂溶液對(duì)自然生長(zhǎng)老齡小鼠骨代謝的作用，本研究采用微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)（Micro CT）和骨微量元素分析，以8月齡自然生長(zhǎng)的小鼠作為空白對(duì)照，并以清除自由基的維生素E作為陽(yáng)性對(duì)照，評(píng)價(jià)該黑芝麻油卵磷脂溶液的骨藥理學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

24只8月齡昆明種SPF級(jí)小白鼠，體質(zhì)量為（47.84±4.92） g，雌雄各半：南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（動(dòng)物質(zhì)量合格證為：SCXK（粵）2011-0015）。

黑芝麻油（批號(hào)20140120）：平輿康博匯鑫油脂有限公司；卵磷脂（批號(hào)：714B024）：北京索萊寶科技有限公司；維生素E軟膠囊（批號(hào)：JE40007）：廣州星群（藥業(yè)）股份有限公司；生理鹽水（批號(hào)：14082501）：東莞市普濟(jì)藥業(yè)有限公司；羥脯氨酸測(cè)試盒：南京建成生物工程研究所。

實(shí)驗(yàn)時(shí)用黑芝麻油配成 70 mg/mL的黑芝麻油-卵磷脂油溶液；實(shí)驗(yàn)時(shí)用70 mg/mL黑芝麻油-卵磷脂油溶液配成維生素 E-黑芝麻油-卵磷脂油溶液。

BT 25S電子天平：賽多利斯公司；電熱恒溫電烤箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠(chǎng)；電感偶合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP）：美國(guó)TJA公司；Eppendorf 5415R小型高速冷凍離心機(jī)：德國(guó) Eppendorf公司；Micro CT儀（viva CT40）：瑞士SCANCO Medical AG公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

取上述小鼠按體重隨機(jī)分為3組，每組8只，（1）生理鹽水組（NS組）：給予生理鹽水灌胃；（2）黑芝麻油-卵磷脂油溶液（Oil組）：給予70 mg/mL的黑芝麻油-卵磷脂油溶液灌胃；（3）維生素E-黑芝麻油-卵磷脂油溶液（VE組）：給予 25 mg/mL的維生素 E-黑芝麻油-卵磷脂油溶液灌胃。上述動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件相同，自由飲水和攝食。灌胃計(jì)量為10 mL/kg/d，實(shí)驗(yàn)持續(xù)10周。每周稱(chēng)體重1次，并按體重調(diào)整給藥的劑量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，小鼠進(jìn)行頸椎脫臼處死，取右側(cè)股骨進(jìn)行Micro CT掃描，取左側(cè)尺骨進(jìn)行骨成分含量測(cè)定。

1.3 觀(guān)察指標(biāo)及測(cè)定方法

1.3.1 小鼠體重的觀(guān)察

小鼠按每周稱(chēng)體重一次，于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前一天停止供應(yīng)飼料，進(jìn)行禁食12 h，稱(chēng)重一次，作為小鼠最后的體重[6]。

1.3.2 Micro CT對(duì)小鼠股骨的分析

小鼠右側(cè)股骨除盡肌肉和附著組織后，放入Micro CT儀進(jìn)行X射線(xiàn)掃描。Micro CT掃描條件如下：能量/強(qiáng)度為70 kVp，114 μA，8 W，整合時(shí)間為200 ms，圖像矩陣為2 048×2 048。以0°旋轉(zhuǎn)進(jìn)行Micro CT掃描。掃描結(jié)束后，選取距離生長(zhǎng)板遠(yuǎn)端1.0 mm、層厚為2.0 mm的骨組織進(jìn)行三維重建，以最低閾值為160提取三維圖像信息。使用儀器自帶軟件（SCANCO Medical AG）進(jìn)行參數(shù)分析，參數(shù)選取骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分離度（Tb.Sp）、骨密度（Density）、骨小梁連接密度（Conn-Dens）、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)（SMI）及各向異性（DA）[7]。

1.3.3 小鼠羥脯氨酸、骨鎂和骨鈣含量的測(cè)定

精密稱(chēng)重小鼠左側(cè)尺骨，后置于烤箱于80 ℃烘烤72 h后至恒重，再次精密稱(chēng)重并記錄數(shù)據(jù)。之后將烘烤干的每一份骨組織標(biāo)本放進(jìn)10 mL安瓿瓶中，分別加入6 mol/L的鹽酸5 mL，然后酒精噴燈火燒密封安瓿瓶瓶口，再于108 ℃烤箱中消化24 h，之后取出過(guò)濾。量取0.25 mL尺骨原濾液，加入蒸餾水稀釋至5 mL，搖勻后為稀釋液。將骨稀釋液分成兩份，一份取 1 mL骨稀釋液，按照羥脯氨酸試劑盒的方法，測(cè)定吸光度，計(jì)算羥脯氨酸的含量，一份取骨稀釋液用ICP儀測(cè)定骨鎂、鈣的含量，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品含量和樣品稀釋倍數(shù)來(lái)計(jì)算鎂、鈣的含量[8]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體重的變化

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，各組間小鼠體重的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，NS組小鼠體重比實(shí)驗(yàn)前降低 9.63%，VE組小鼠體重比實(shí)驗(yàn)前降低3.06%，Oil組小鼠體重比實(shí)驗(yàn)前降低9.85%，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)后，各組小鼠體重均比實(shí)驗(yàn)前有所降低。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 小鼠體重的變化Table 1 Changes in body weight of mice

2.2 小鼠骨成分的變化

與NS組相比，VE組骨羥脯氨酸、骨鎂和骨鈣含量差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明維生素E-黑芝麻油卵磷脂溶液不能改善自然生長(zhǎng)老齡小鼠骨礦物質(zhì)和有機(jī)質(zhì)的丟失；Oil組骨鎂和骨鈣含量均顯著增加，分別增加了 53.44%（P＜0.01）、58.04%（P＜0.01），說(shuō)明黑芝麻油卵磷脂溶液可以抵抗骨礦物質(zhì)的丟失。與VE組相比，Oil組骨鎂和骨鈣含量均顯著增加，分別增加了29.83%（P＜0.01）、42.31%（P＜0.05），說(shuō)明黑芝麻油卵磷脂溶液增加骨礦物質(zhì)的作用較維生素 E-黑芝麻油卵磷脂溶液強(qiáng)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 小鼠尺骨干重，濕重，羥脯氨酸，鎂和鈣含量的變化Table 2 Variation of dry weight,wet weight,hydroxyproline,magnesium and calcium content of mouse ulna

2.3 小鼠Micro CT參數(shù)的變化

2.3.1 小鼠Micro CT掃描三維重建圖的變化

圖A為NS組，NS組骨小梁出現(xiàn)了斷裂變短，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)退化，有較大的間隙出現(xiàn)在中央?yún)^(qū)域，這表明老齡小鼠給予生理鹽水 10周后，小鼠股骨的骨量減少，骨微觀(guān)結(jié)構(gòu)受到破壞。B為VE組，骨小梁數(shù)目增加且變粗，間隙變小，連續(xù)性得到一定的恢復(fù)。C為Oil組，骨小梁分布排列緊密，均勻有序且間隙較小，連續(xù)性較好。以上結(jié)果表明維生素 E-黑芝麻油卵磷脂溶液和黑芝麻油卵磷脂溶液均不同程度的增加自然生長(zhǎng)老齡小鼠股骨的骨量，微觀(guān)結(jié)構(gòu)均有不同程度的改善。結(jié)果見(jiàn)圖1～3。

圖1 小鼠股骨Micro CT的三維重建圖（SEG圖）Fig.1 Three-dimensional reconstruction image of mouse femur by Micro CT (SEG image)

圖2 小鼠股骨Micro CT的三維重建圖（TH圖）Fig.2 Three-dimensional reconstruction image of mouse femur by Micro CT (TH image)

圖3 小鼠股骨Micro CT的三維重建圖（SP圖）Fig.3 Three-dimensional reconstruction image of mouse femur by Micro CT (SP image)

2.3.2 小鼠股骨Micro CT掃描參數(shù)的變化

與 NS組相比，VE組股骨 Micro CT參數(shù)BV/TV、Density和Conn-Dens均顯著增加，分別增加了 77.78%（P＜0.01）、71.24%（P＜0.01）、8.91%（P＜0.01），SMI顯著降低，降低了 36.54%（P＜0.01），說(shuō)明維生素 E-黑芝麻油卵磷脂溶液可以增加正常生長(zhǎng)老齡小鼠股骨的骨密度，骨小梁由桿狀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榘鍫罱Y(jié)構(gòu)；Oil組Conn-Dens顯著增加 138.77%（P＜0.01），BV/TV、Density有所增加，分別增加了33.33%、31.27%，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明黑芝麻油卵磷脂溶液可以改善骨小梁的微觀(guān)結(jié)構(gòu)，骨微觀(guān)結(jié)構(gòu)得到一定的改善。結(jié)果見(jiàn)表3和表4。

表3 小鼠股骨Micro CT掃描參數(shù)的變化Table 3 Variation of Micro CT scan parameters of mouse femur

表4 小鼠股骨Micro CT掃描參數(shù)的變化Table 4 Variation of Micro CT scan parameters of mouse femur

3 結(jié)論

3.1 維生素E對(duì)自然生長(zhǎng)8月齡小鼠骨代謝的作用

本實(shí)驗(yàn)中，開(kāi)始用藥前，各組間小鼠體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，VE組小鼠體重比實(shí)驗(yàn)前有所降低，說(shuō)明隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間增加，維生素 E-黑芝麻油卵磷脂溶液可使自然生長(zhǎng)老齡小鼠體重稍有降低。與NS組相比，VE組骨羥脯氨酸、骨鎂和鈣骨含量差別均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明維生素 E-黑芝麻油卵磷脂溶液不能改善自然生長(zhǎng)老齡小鼠骨礦物質(zhì)和有機(jī)質(zhì)的丟失。從 Micro CT三維圖可看出，VE組骨小梁數(shù)目增加且變粗，間隙變小，連續(xù)性得到一定的恢復(fù)。與 NS組相比，VE組股骨Micro CT指標(biāo)的BV/TV和Density均顯著增加，SMI顯著降低，說(shuō)明維生素E-黑芝麻油卵磷脂溶液可以增加正常生長(zhǎng)老齡小鼠股骨的骨密度，骨小梁由桿狀結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榘鍫罱Y(jié)構(gòu)。

維生素E作為抗氧化劑，可增加谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性，增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力；可減輕運(yùn)動(dòng)中抗氧化酶所受的自由基損傷，減緩疲勞出現(xiàn)，從而提高運(yùn)動(dòng)的能力；還可以直接控制線(xiàn)粒體內(nèi)過(guò)氧化氫的產(chǎn)生[9-10]。此外，維生素E的衍生物普遍參與質(zhì)膜的組成，可增強(qiáng)肌纖維膜、線(xiàn)粒體膜和肌漿網(wǎng)膜的完整性和穩(wěn)定性，防止肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+的大量溢出引發(fā)的骨骼肌損傷[11]。而氧化應(yīng)激與骨之間具有明確的生物聯(lián)系，自由基可降解骨基質(zhì)，降低骨形成活性；活化并促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化，激活骨吸收；抑制成骨細(xì)胞的分化，誘導(dǎo)單核細(xì)胞遷移并將單核細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞，從而導(dǎo)致骨重建的解偶效應(yīng)[2,12]。張益嘉等[3]研究發(fā)現(xiàn)，維生素 E通過(guò)清除自由基，解除體內(nèi)產(chǎn)物對(duì)成骨細(xì)胞的抑制，同時(shí)減少自由基對(duì)骨膠原分子的破壞使骨有機(jī)質(zhì)恢復(fù)，從而恢復(fù)骨量。另外，研究發(fā)現(xiàn)[13]，維生素C和E與不抽煙的絕經(jīng)后婦女骨吸收指標(biāo) I型膠原羧基末端肽水平呈負(fù)相關(guān)，可以抑制骨吸收。賈巖波等[14]研究表明，維生素 E可通過(guò)促進(jìn) bcl-2的表達(dá)和抑制Caspase-3的表達(dá)來(lái)抑制骨細(xì)胞凋亡，從而緩解激素所致的骨損傷。此外，有報(bào)道[15]，通過(guò)基因操作獲得不吸收維生素E的小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的破骨細(xì)胞比正常的要小，無(wú)法順利吸收骨骼，起到抗骨質(zhì)疏松作用。本研究結(jié)果顯示，維生素 E可使自然生長(zhǎng)小鼠的骨密度增加，結(jié)構(gòu)模型指數(shù)減少，說(shuō)明其對(duì)自然生長(zhǎng)小鼠所引起的骨丟失有一定的預(yù)防作用。這可能是因?yàn)榫S生素E可通過(guò)抑制自由基，防止骨的變性，使得骨吸收減少，起到防止自然衰老導(dǎo)致的骨量減少，說(shuō)明維生素E在骨骼生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮了積極作用。

3.2 黑芝麻油對(duì)自然生長(zhǎng) 8月齡小鼠骨代謝的影響

本實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，Oil組小鼠體重比實(shí)驗(yàn)前有所降低，說(shuō)明隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間增加，黑芝麻油卵磷脂溶液可使自然生長(zhǎng)老齡小鼠體重稍有降低。與NS組相比，Oil組骨鎂和骨鈣含量均顯著增加，說(shuō)明黑芝麻油卵磷脂溶液可以抵抗骨礦物質(zhì)的丟失。與VE組相比，Oil組骨鈣和骨鎂含量均顯著增加，說(shuō)明黑芝麻油卵磷脂溶液增加骨礦物質(zhì)的作用較維生素E強(qiáng)。從Micro CT三維圖可看出，Oil組的骨小梁分布排列緊密，均勻有序且間隙較小，連續(xù)性較好，表明黑芝麻油卵磷脂溶液可在一定程度上增加自然生長(zhǎng)老齡小鼠股骨的骨量，微觀(guān)結(jié)構(gòu)得到改善。與NS組相比，Oil組Conn-Dens顯著增加，而B(niǎo)V/TV、Density均有所增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明黑芝麻油卵磷脂溶液可以改善骨小梁的微觀(guān)結(jié)構(gòu)，骨微觀(guān)結(jié)構(gòu)得到一定的改善。

黑芝麻含有多種人體必需氨基酸，含有的維生素E和維生素B1能加速人體代謝功能；含有的鐵和維生素E可預(yù)防貧血、活化腦細(xì)胞、消除血管膽固醇；含有的不飽和脂肪酸，有延年益壽作用[16]。黑芝麻油來(lái)源于黑芝麻，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黑芝麻油同樣可以預(yù)防自然生長(zhǎng)致小鼠骨丟失，而增加骨鈣、骨鎂的效果比維生素E更顯著，黑芝麻油預(yù)防自然生長(zhǎng)致小鼠骨丟失的機(jī)制可能與必需脂肪酸有關(guān)，可以通過(guò)增加維生素D的活性，加強(qiáng)機(jī)體吸收腸道的鈣，減少腎鈣的排出，從而使鈣沉積在骨骼，以增強(qiáng)骨的強(qiáng)度。另外，黑芝麻油含有大量如亞油酸、亞麻酸等多種必需脂肪酸，有利于鈣的吸收和促進(jìn)骨的重吸收，還可促進(jìn)骨的形成[3]，這都有利于預(yù)防骨質(zhì)疏松。因此推測(cè)，黑芝麻油可通過(guò)清除自由基，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化的能力，從而消除自然生長(zhǎng)對(duì)小鼠骨代謝的不利影響。而其機(jī)制可能是黑芝麻油中含有維生素E和不飽和脂肪酸等與成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞活性的調(diào)控有關(guān)，但具體機(jī)制有待下一步研究。

3.3 小結(jié)

自然生長(zhǎng)老齡小鼠給予生理鹽水10周后，小鼠股骨的骨量減少，微觀(guān)結(jié)構(gòu)受到破壞。黑芝麻油卵磷脂溶液雖不能明顯增加自然生長(zhǎng)老齡小鼠股骨的骨量，到可以增加骨鈣和骨鎂的含量，并且可以改善股骨微觀(guān)結(jié)構(gòu)，提示具有抗骨質(zhì)疏松的良好應(yīng)用前景。