玉米赤霉烯酮時(shí)間分辨熒光試紙條的制備及特性研究

顧建華，嚴(yán)藝琳，楊婷婷?，祁蘇嫻，張海濤，王寶春

（1.蘇州市吳中區(qū)糧食質(zhì)量監(jiān)督管理站，江蘇 蘇州 215128；2.江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇 無錫 214063；3.淮安市城南糧庫，江蘇 淮安 223200）

玉米赤霉烯酮，又名F-2毒素（Zearalenone，簡稱 ZEN），是一種由鐮刀菌屬真菌分泌的類雌激素霉菌毒素，最初從發(fā)霉玉米中分離得到，普遍存在于玉米、小麥、大米、大麥、燕麥等農(nóng)作物中，對動(dòng)物的肝臟等器官造成較大損傷，在動(dòng)物體內(nèi)蓄積，引起動(dòng)物機(jī)能異常甚至死亡，給農(nóng)場造成巨大的影響和經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。目前，世界各地都對食品、谷物和飼料中的玉米赤霉烯酮的含量做了嚴(yán)格的規(guī)范，并制定了相應(yīng)的玉米赤霉烯酮限量標(biāo)準(zhǔn)。例如歐盟除單獨(dú)規(guī)定玉米外，對小麥、稻谷等供人直接食用的谷物統(tǒng)一規(guī)定玉米赤霉烯酮含量不能超過100 μg/kg[4]，我國《GB 2761—2017食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》中明確規(guī)定谷物及其制品中玉米赤霉烯酮的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為 60 μg/kg[5]。因此，在現(xiàn)如今食品加工和畜牧業(yè)生產(chǎn)中，對這種有害人身體健康的真菌毒素的防控就顯得尤為重要。

目前，常用的檢測糧食中玉米赤霉烯酮的方法有：高效液相色譜法、薄層色譜法、免疫分析方法、液相色譜-質(zhì)譜法[6-8]等。HPLC檢測法作為國標(biāo)中的第一法，應(yīng)用最為廣泛，雖然該方法靈敏度較高，檢測極限低，但此方法檢測過程較為復(fù)雜，儀器價(jià)格昂貴，對操作人員要求較高，操作時(shí)間長，不利于檢測技術(shù)的現(xiàn)場推廣應(yīng)用。ELISA法雖然操作簡單、靈敏度高，但不適合現(xiàn)場檢測。時(shí)間分辨熒光免疫分析測定是一種新一代標(biāo)記免疫測定技術(shù)，根據(jù)鑭系元素螯合物的長壽命的發(fā)光特點(diǎn)，用時(shí)間分辨技術(shù)測量熒光，通過同時(shí)檢測波長和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，具有靈敏度高、快速、靈活，試劑無放射性污染等特點(diǎn)[9-10]，在醫(yī)療、環(huán)境、食品等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[11-14]。

“舌尖上的安全”需要以方便、快速、準(zhǔn)確、易普及的檢測技術(shù)作為支撐，為更好的發(fā)揮快檢方法對食品安全監(jiān)控的基礎(chǔ)支撐作用，在傳統(tǒng)的膠體金免疫層析半定量技術(shù)基礎(chǔ)上，對抗體標(biāo)記物及標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行革新，建立了玉米赤霉烯酮時(shí)間分辨免疫層析定量檢測法。該方法采用高靈敏度有機(jī)熒光納米微球作為示蹤物來標(biāo)記抗體，提高了標(biāo)記物的穩(wěn)定性。微球包裹的銪元素在340 nm紫外光源的照射下發(fā)出高強(qiáng)度的熒光，且該熒光壽命長，利用延緩測量時(shí)間，待樣品基質(zhì)中自然發(fā)生的短壽命熒光（1～10 ns）全部衰變后，再測量稀土元素的特異性熒光，這樣可以更多的排除特異本底熒光的干擾，解決了食品檢測過程中基質(zhì)干擾問題，提升了檢測的準(zhǔn)確度，適合大批樣品的測定，在市場上更容易受到青睞[15]。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）、碳二亞胺（EDC）、N-羥基硫代琥珀酰亞胺（NHS）、牛血清白蛋白（BSA）：Sigma-Aldrich公司；ZEN-BSA偶聯(lián)物、抗玉米赤霉烯酮單抗（純度≥95%，蛋白濃度18.49 mg/mL，亞型IgG2a，親和常數(shù)9.8×107L/mol，與ZEN、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉烯醇、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇以及玉米赤霉酮的交叉反應(yīng)率分別為100%、95%、38%、133%、69%和 118%）：江蘇省蘇微微生物研究有限公司制備；羊抗鼠IgG（10 mg/mL）：上海杰一生物有限公司；銪Eu3+納米微球（平均粒徑200 nm，表面活性基團(tuán)-COOH，激發(fā)365 nm、發(fā)射 615 nm）：長沙美牛生物科技有限公司；硝酸纖維素膜CN95、CN140：德國賽多利斯；硝酸纖維素膜Pall90：美國Pall公司；樣品墊（SB08）、吸水紙（SX27）、PVC底板（SM31-25）：上海金標(biāo)生物科技有限公司；玉米、小麥等糧食及其制品：市場購買。

SW-2時(shí)間分辨熒光檢測儀、ZEN親和柱：江蘇省蘇微微生物研究有限公司；GL-21M 高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HS-3垂直混勻儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；JP-100T超聲機(jī)：深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；BPG-9240A精密鼓風(fēng)干燥箱：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；HM3035三維劃膜噴金儀、CTS300數(shù)控裁條機(jī)、ZQ2000自動(dòng)斬切機(jī)：上海金標(biāo)生物科技有限公司；LC-20AT液相色譜儀：日本島津公司；色譜柱（HP-C18，4.6*150 mm，5 μm）：美國賽芬科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗ZEN單抗的熒光納米微球標(biāo)記

將 200 nm時(shí)間分辨熒光微球超聲分散10 min，取100 μL超聲后的微球于2 mL圓底離心管中，加入 900 μL超純水混勻，并超聲分散5 min。分別配制 50 mg/mL N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）與碳二亞胺（EDC）的乙醇溶液，各取50 μL加入微球懸液，混勻后于垂直混勻儀上活化40 min，15 000 r/min離心30 min，去上清，加入1 mL超純水，超聲5 min使微球分散。于活化后的微球懸液中加入抗ZEN抗體，置于垂直混勻儀上反應(yīng)2 h，加入BSA使之最終濃度為0.5%，封閉1 h，15 000 r/min離心30 min，去上清，加入1 mL微球保存液超聲分散后冷藏備用。

1.2.2 層析膜的制備

將裁成25×300 mm的硝酸纖維素膜，置于三維劃膜噴金儀平臺(tái)上；用含 1.5%蔗糖和 1.5%海藻糖的 PBS（0.01 mol/L/pH7.2）分別溶解ZEN-BSA包被抗原和羊抗鼠IgG至一定濃度，分別放于存儲(chǔ)池A和B；以1 μL/cm的劃膜量分別將上述溶液劃線于 NC膜中央，形成檢測線和質(zhì)控線印跡，兩者相距4 mm，其中質(zhì)控線距離試紙條頂端25 mm；于45 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥24 h以上，將層析膜置于鋁箔袋中，干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 熒光免疫試紙條的組裝

以PVC膠粘板作襯板，將層析膜粘貼在襯板的中央。將樣品墊、吸水紙分別粘貼在層析膜的兩端，并且兩墊之間有1～2 mm的交聯(lián)。將組裝好的試紙條大板用自動(dòng)斬切機(jī)切割成寬4 mm、長60 mm的板條，裝于塑料卡殼中，用壓殼機(jī)壓緊。放入帶干燥劑的鋁箔袋中，連續(xù)封口機(jī)封口后，常溫保存。

1.2.4 反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.2.4.1 熒光微球標(biāo)記的抗體和包被抗原濃度的優(yōu)化 將C線上二抗的濃度固定為0.5 mg/mL，通過改變T線上ZEN-BSA包被抗原和熒光微球標(biāo)記單抗的濃度，以ZEN標(biāo)準(zhǔn)溶液來考察所制成的試紙條，選擇熒光背景弱、熒光峰值高，且 T線與C線的熒光強(qiáng)度之比在 1.0～2.0之間的作為包被抗原與標(biāo)記抗體的最佳濃度。

1.2.4.2 原材料的選擇 選擇 Pall 90、Starorius CN140和Starorius CN95三種不同規(guī)格的硝酸纖維素膜，按照上述確定的優(yōu)化條件，用ZEN系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2.5、5、10 ng/mL）點(diǎn)樣，觀察熒光微球在NC膜上的移動(dòng)速度、背景是否干凈等；反應(yīng)結(jié)束后，采用時(shí)間分辨熒光免疫分析儀讀數(shù)，考察線性范圍和相關(guān)系數(shù)（R2）等，優(yōu)選出合適的硝酸纖維素膜。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在 1.2.4確定的最佳優(yōu)化條件下，準(zhǔn)確配制0.01 mol/L的 pH為 7.2的磷酸鹽緩沖液，加入0.4%的吐溫-20，將熒光微球標(biāo)記的抗ZEN抗體以此分析緩沖液稀釋至合適倍數(shù)作為樣品稀釋液。將ZEN的標(biāo)準(zhǔn)品，用50%乙腈-水（體積比）定容配制成410.4 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；再用5%甲醇-樣品稀釋液（體積比）稀釋成0.00、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/mL 濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。分別取100 μL加至試紙條的樣品孔中，25 ℃下反應(yīng)10 min，由低濃度到高濃度進(jìn)行檢測，時(shí)間分辨熒光儀檢測T線熒光強(qiáng)度與C線熒光強(qiáng)度，計(jì)算T/C值。以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度的自然對數(shù)值（lnC）為橫坐標(biāo)，各濃度標(biāo)準(zhǔn)液的T/C值與0 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)液的T/C值的比值所得百分比為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 樣品處理與測定

準(zhǔn)確稱取5 g粉碎均勻樣本，量取25 mL 80%甲醇-水至 50 mL離心管中，混勻，密封；至漩渦混勻器上渦旋提取 2 min，于離心機(jī)中4 000 r/min離心5 min，得上清液。測試前將未開封的檢測卡及待檢樣本平衡至 25 ℃；將檢測卡平放，用移液器定量吸取50 μL清液加入750 μL樣本稀釋液中，至漩渦混勻器上混勻，后再吸出100 μL此混合液垂直滴加于加樣孔中，開始計(jì)時(shí)；反應(yīng)10 min后，將檢測卡放入時(shí)間分辨熒光免疫層析檢測儀中，儀器讀數(shù)完成后會(huì)自動(dòng)計(jì)算出被檢樣本中的ZEN含量，可選擇儲(chǔ)存及打印結(jié)果。

1.2.7 方法學(xué)評價(jià)

1.2.7.1 檢出限與定量限 取 20組無污染的樣品，用玉米赤霉烯酮定量試紙條對其進(jìn)行檢測，以空白樣品 20次測定結(jié)果的均值加 3倍的標(biāo)準(zhǔn)差，即為檢出限；以測定結(jié)果的均值加10倍的標(biāo)準(zhǔn)差，即為定量限[16-17]。

1.2.7.2 穩(wěn)定性 本實(shí)驗(yàn)測試試紙條在 1年的保存時(shí)間是否有效，根據(jù)阿倫尼烏斯公式，將試紙條是置于50 ℃老化23 d未變質(zhì)，相當(dāng)于室溫1年有效[18-19]。本實(shí)驗(yàn)將試紙條置于50 ℃ 42 d加速反應(yīng)后與未加速的試紙條作對比，考察其穩(wěn)定性。

1.2.7.3 準(zhǔn)確性與重復(fù)性 采用空白樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，在小麥、玉米陰性樣本中分別加入低、中、高濃度的ZEN標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)SW-2時(shí)間分辨熒光檢測儀T/C值和標(biāo)準(zhǔn)曲線得出檢測濃度。加標(biāo)回收率=（實(shí)測濃度-空白濃度）/加標(biāo)濃度×100%。

1.2.7.4 與 HPLC法對比驗(yàn)證 選取小麥、玉米等樣本共20份，按1.2.6方法處理，同一份樣品分別采用ZEN熒光試紙條和IAC-HPLC法進(jìn)行測定。結(jié)果對比分析，進(jìn)一步驗(yàn)證該方法與國家標(biāo)準(zhǔn)方法的一致性。

1.2.7.5 特異性 配制 1.0 ng/mL的玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素A這4種毒素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用本實(shí)驗(yàn)建立的檢測方法進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.1.1 熒光微球標(biāo)記單抗?jié)舛燃鞍豢乖瓌澞べ|(zhì)量濃度的確定

不同包被抗原與標(biāo)記單抗?jié)舛鹊钠ヅ浣Y(jié)果見表 1，標(biāo)記單抗的量越多，對于不同濃度的ZEN抑制率越差，但單抗用量不可過少，選擇合適的熒光強(qiáng)度之比，確定劃膜濃度為 0.1 mg/mL，熒光微球標(biāo)記的單抗終濃度為0.02 mg/mL。

表1 包被抗原與標(biāo)記單抗?jié)舛鹊拇_定Table 1 Determination of the concentration of antigens and labeled antibodies

2.1.2 原材料確定

三種硝酸纖維素膜對顯色和線性的檢測結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，賽多利斯CN95膜的顯色速度較快，背景清晰干凈，且線性良好。從表3三種硝酸纖維素膜對熒光強(qiáng)度和 T/C的影響結(jié)果來看，在同樣的 T線包被濃度下，賽多利斯 CN95膜所測出的熒光強(qiáng)度較其他兩種膜要高。因此，從節(jié)約原材料成本方面等方面綜合考慮，最終選擇賽多利斯CN95膜作為本研究最佳的NC膜材料。

表2 三種規(guī)格硝酸纖維素膜對顯色和線性的影響Table 2 Effect of three types of nitrocellulose films on color development and linearity

表3 三種規(guī)格硝酸纖維素膜對熒光強(qiáng)度和T/C值的影響Table 3 Effects of three types of nitrocellulose films on fluorescence intensity and T/C value

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

由圖1可以發(fā)現(xiàn)橫坐標(biāo)采用的是濃度的自然對數(shù)，但是通過繪制得到的是平滑的S曲線，這與免疫競爭得到的曲線是一致的[20]；同時(shí)在0.1～5 ng/mL濃度范圍內(nèi)，有效劑量值即抑制率（以下采用 B/B0表示）在 92%～19%，線性回歸相關(guān)系數(shù) R2達(dá) 0.993 3，直線方程 y = -0.183 6x +0.475 7。由此，確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍，并以此作為以下實(shí)驗(yàn)的線性濃度。

圖1 不同濃度（0.05～10 ng/mL）平滑曲線Fig.1 Smooth curve of different concentrations (0.05～10 ng/mL)

2.3 檢測限和定量限的確定

測定結(jié)果和計(jì)算結(jié)果見表 4。方法的檢出限為 10.05 μg/kg、定量限為 20.13 μg/kg。

表4 方法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）（n=20）Table 4 The limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) of wheat flour

2.4 穩(wěn)定性分析

檢測結(jié)果如圖 2所示，試紙條在 50 ℃存放28 d時(shí)，T/C值無明顯下降，在35 d之后，T/C值略有下降，說明試紙條在常溫下1年的穩(wěn)定性良好。

圖2 試紙條穩(wěn)定性分析Fig.2 Stability analysis of test strips

2.5 準(zhǔn)確性和重復(fù)性分析

根據(jù)國家限量標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)定3個(gè)濃度，涵蓋低、中、高濃度的加標(biāo)回收測定。分別對陰性小麥及玉米進(jìn)行不同水平的ZEN加標(biāo)，加標(biāo)濃度分別為20、60及120 μg/kg，用ZEN熒光試紙條重復(fù)測定5次，計(jì)算平均回收率在93.45%～112.2%之間，5次重復(fù)的變異系數(shù)在6.81%～12.31%之間（見表5）。

表5 小麥、玉米不同濃度加標(biāo)回收率（n=5）Table 5 The recovery rate of different concentrations of wheat and corn (n=5)

2.6 與HPLC法對比驗(yàn)證結(jié)果

將兩種方法對 20份典型樣品的檢測結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果如圖 3，兩種方法的線性回歸系數(shù) R2=0.959 2，結(jié)果高度相關(guān)，具有良好的一致性。

圖3 HPLC與試紙條測定樣品中ZEN的相關(guān)性Fig.3 Correlation between HPLC and test strips in the determination of ZEN in samples

2.7 試紙條的特異性

用ZEN熒光試紙條分別測定1.0 ng/mL的玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素A這4種毒素的標(biāo)準(zhǔn)品，最后計(jì)算得出與玉米赤霉酮與黃曲霉毒素B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素A基本無交叉反應(yīng)，說明該產(chǎn)品特異性良好。

3 結(jié)論

本研究方法基于抗原抗體的特異性免疫反應(yīng)原理，采用高靈敏度有機(jī)熒光微球作為示蹤物這一新方法來標(biāo)記抗體，從市場需求出發(fā)，創(chuàng)新性地研制出玉米赤霉烯酮時(shí)間分辨熒光免疫層析卡為核心產(chǎn)品的霉菌毒素快速檢測系統(tǒng)，具有小型、便攜、智能化等優(yōu)點(diǎn)，形成了易于推廣和應(yīng)用的霉菌毒素快速檢測系統(tǒng)用戶終端。

本實(shí)驗(yàn)研制的玉米赤霉烯酮快速定量免疫試紙條，采用銪納米微球作為熒光探針，標(biāo)記抗ZEN的單抗，通過競爭抑制建立免疫層析定量方法。試紙條的靈敏度為0.1 ng/mL，檢出限為10.05 μg/kg，定量限為20.13 μg/kg，顯著高于膠體金方法和酶聯(lián)免疫法的靈敏度，與一般的ELISA方法相比，試紙條的操作更加簡便，所需時(shí)間更短，可為實(shí)驗(yàn)人員減輕負(fù)擔(dān)。其次，其他方法學(xué)參數(shù)評價(jià)結(jié)果表明，樣品的加標(biāo)回收率在 93.45%～112.2%之間，對于同一個(gè)樣品的5次重復(fù)的變異系數(shù)均小于15%，采用IAC-HPLC法和試紙條同時(shí)檢測小麥、玉米等20份樣品，結(jié)果表明這兩種方法具有良好的相關(guān)性。其準(zhǔn)確性和可靠性基本滿足了絕大多數(shù)糧食及其制品中玉米赤霉烯酮的檢測。

時(shí)間分辨熒光試紙條操作簡單，簡單樣本只需甲醇提取處理即可測定，從提樣至得出結(jié)果只需25 min；配套小型經(jīng)濟(jì)、便于攜帶的熒光分析儀，不僅降低了企業(yè)的檢測成本，還有效提升了企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量的檢測能力，同時(shí)也為政府職能部門提供了快速、有效、易于普及的檢測技術(shù)和手段，尤其適合基層單位，便于大量樣本的篩選。因此，具有非常好的推廣應(yīng)用價(jià)值，有利于保障食品的質(zhì)量安全和消費(fèi)者的健康。