維甲酸對(duì)異位子宮內(nèi)膜組織自噬和血管生成的影響

馬宇倩　馬孝紅　路會(huì)俠

【摘要】 目的：觀察小鼠異位子宮內(nèi)膜組織中自噬標(biāo)記物Beclin 1及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)變化情況，探討維甲酸（Retinoic Acid，RA）對(duì)異位子宮內(nèi)膜病灶中自噬及血管生成的作用。方法：100只BALB/c雌性小鼠分為5組：CTRL組，EMs組，LOW組[100 mg/（kg·d）]，HIGH組[200 mg/（kg·d）]，CQ組;藥物灌胃7 d后處死取材，行Real-time PCR，Western blotting定量分析及MVD測(cè)定。結(jié)果：EMs組、LOW組Beclin 1、VEGF mRNA表達(dá)均高于CTRL組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;HIGH組Beclin 1、VEGF mRNA表達(dá)均低于LOW組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。EMs組、LOW組Beclin 1、VEGF蛋白表達(dá)均高于CTRL組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;HIGH組Beclin 1、VEGF蛋白表達(dá)均低于LOW組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。EMs組、LOW組MVD計(jì)數(shù)均高于CTRL組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;HIGH組MVD計(jì)數(shù)低于LOW組和EMs組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：高劑量維甲酸可抑制EMs異位病灶中的自噬及血管生成。

【關(guān)鍵詞】 子宮內(nèi)膜異位癥 維甲酸 自噬 血管生成

Effects of Retinoic Acid on Autophagy and Angiogenesis in Ectopic Endometrial Tissue/MA Yuqian， MA Xiaohong， LU Huixia. //Medical Innovation of China， 2021， 18（36）： 0-026

[Abstract] Objective： To observe the expression of autophagy marker Beclin 1 and vascular endothelial growth factor （VEGF） in mouse ectopic endometrium， and to explore the effect of Retinoic Acid （RA） on autophagy and angiogenesis in ectopic endometrium. Method： 100 BALB/c female mice were divided into 5 groups， CTRL group， EMs group， LOW group [100 mg/（kg·d）]， HIGH group [200 mg/（kg·d）]， CQ group; after 7 days of drug gavage， they were killed and taken for real-time PCR， Western blotting quantitative analysis and MVD determination. Result： The mRNA expressions of Beclin 1 and VEGF in EMs group and LOW group were higher than those in CTRL group， the differences were statistically significant （P<0.05）; the mRNA expressions of Beclin 1 and VEGF in HIGH group were lower than those in LOW group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The protein expressions of Beclin 1 and VEGF in EMs group and LOW group were higher than those in CTRL group， the differences were statistically significant （P<0.05）; the protein expressions of Beclin 1 and VEGF in HIGH group were lower than those in LOW group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The MVD counts in EMs group and LOW group were higher than those in CTRL group， the differences were statistically significant （P<0.05）; the MVD count in HIGH group was lower than that in LOW group and EMs group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion： High dose Retinoic Acid can inhibit autophagy and angiogenesis in ectopic lesions of EMs.

[Key words] Endometriosis Retinoic Acid Autophagy Angiogenesis

First-author’s address： Clinical Medicine Collage of Dali University， Yunnan Province， Dali 671000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.36.006

子宮內(nèi)膜異位癥（Endometriosis，EMs）是有生長(zhǎng)活性的子宮內(nèi)膜組織、腺體和間質(zhì)，異位到子宮腔以外的部位并生長(zhǎng)，發(fā)病機(jī)制與自噬（autophagy）密切相關(guān)[1]。組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)異位內(nèi)膜組織最典型的特征之一就是密集的血管化及高表達(dá)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）[2]，臨床使用抗血管治療可以降低EMs的復(fù)發(fā)率[3]。維甲酸（Retinoic Acid，RA）主要用于治療某些細(xì)胞增殖性疾病和高VEGF表達(dá)的疾病。RA可通過(guò)抑制細(xì)胞自噬從而抑制高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成[4]。

筆者前期研究發(fā)現(xiàn)RA在體外可誘導(dǎo)異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中自噬標(biāo)記物Beclin 1表達(dá)增加[5]，但體內(nèi)異位內(nèi)膜組織中RA如何影響自噬，是否對(duì)EMs的血管生成（angiogenesis）有作用尚不清楚。本研究擬使用小鼠動(dòng)物模型觀測(cè)RA對(duì)異位內(nèi)膜組織中Beclin1和VEGF表達(dá)的變化，進(jìn)一步探討RA對(duì)EMs異位內(nèi)膜組織中自噬與血管生成的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 Beclin 1多克隆抗體（美國(guó)Cell Signal公司），VEGF多克隆抗體（美國(guó)Cell Signal公司），氯喹（Chloroquine，CQ），RA（美國(guó) selleckchem公司），山羊抗兔二抗（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥 于2019年5-9月飼養(yǎng)SPF級(jí)BALB/c雌性成年小鼠共100只，體重（25.00±3.49）g，由昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（滇）2014-0011，共分為5組，每組20只。對(duì)照組（CTRL組）正常飼養(yǎng)，未做任何處理;其余采用自體移植法建立人工EMs小鼠模型，造模成功后，隨機(jī)分為：?jiǎn)渭兪中g(shù)組（EMs組），RA低劑量組[LOW組，100 mg/（kg·d）]，RA高劑量組[HIGH組，200 mg/（kg·d）]，氯喹組[CQ組，40 mg/（kg·d）]，各組分別用相應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)治療7 d。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合動(dòng)物倫理要求。7 d后，小鼠斷頭采血備用，同時(shí)摘取卵巢、剝離在位子宮內(nèi)膜和異位子宮內(nèi)膜，常規(guī)固定于4%多聚甲醛中，用于組織切片分析;取部分異位內(nèi)膜組織，去除周?chē)母贡诮M織，液氮冷凍保存待用。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Beclin 1、VEGF mRNA表達(dá) 組織總RNA提取按Trizol試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，進(jìn)行小鼠內(nèi)膜組織總RNA抽提純化和互補(bǔ)脫氧核糖核酸合成。每份樣本設(shè)計(jì)3個(gè)復(fù)孔?；靹蚝螅湃隤CR儀，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 s，95 ℃ 15 s、

60 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，共30個(gè)循環(huán)。樣本RT-qPCR，95 ℃ 1 min，95 ℃ 3 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共35循環(huán)。引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成。見(jiàn)表1。

1.3.2 蛋白印跡法（Western blotting）分析Beclin 1、VEGF蛋白表達(dá) 稱(chēng)標(biāo)本質(zhì)量，勻漿凍干，蛋白小丸用蒸餾水溶解，樣本加到10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）上，電泳分離出待檢測(cè)蛋白后電轉(zhuǎn)移，脫脂牛奶室溫下封閉2 h，用洗脫緩沖液漂洗3次，10 min/次，加入抗體（1︰1 000），4 ℃過(guò)夜，再次漂洗，加入二抗

（1︰2 000），室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯色并照相，用ImageJ分析各條帶吸光度值D。

1.3.3 微血管密度（microvessel density，MVD）測(cè)定 MVD（×200倍鏡下選擇5個(gè)最高M(jìn)VD區(qū)域進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值）。所有剝離出來(lái)的異位內(nèi)膜組織標(biāo)本HE染色后，以抗CD34單克隆抗體標(biāo)記血管中層及斑塊的內(nèi)皮細(xì)胞，然后在高倍鏡下計(jì)數(shù)每一視野的微血管數(shù)，以被染成棕褐色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇作為1個(gè)血管計(jì)數(shù)，只要結(jié)構(gòu)不相連，其分支結(jié)構(gòu)也計(jì)作一條血管。計(jì)數(shù)方法：在至少3個(gè)異位內(nèi)膜血管著色最密集的區(qū)域和高倍鏡（×200，每個(gè)視野面積1.0 mm2）下計(jì)數(shù)微血管數(shù)，并取其平均值作為該片的MVD值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組GAPDH、VEGF、Beclin 1 mRNA表達(dá)水平比較 EMs組、LOW組Beclin 1、VEGF mRNA表達(dá)均高于CTRL組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;HIGH組Beclin 1、VEGF mRNA表達(dá)均低于LOW組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;HIGH組Beclin 1、VEGF mRNA表達(dá)與CTRL比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。HIGH組Beclin 1、VEGF mRNA表達(dá)與CQ組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖1和表2。

2.2 蛋白印跡法分析各組GAPDH、VEGF、Beclin 1

mRNA表達(dá)水平 EMs組、LOW組Beclin 1、VEGF蛋白表達(dá)均高于CTRL組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;HIGH組Beclin 1、VEGF蛋白表達(dá)均低于LOW組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;HIGH組Beclin 1、VEGF蛋白表達(dá)與CQ組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖2、3和表3。

2.3 各組小鼠MVD計(jì)數(shù)比較 依據(jù)Weidne法行MVD計(jì)數(shù)，CD34染色的微血管結(jié)構(gòu)（圖4）。CTRL組MVD計(jì)數(shù)為（21.69±6.73），EMs組MVD計(jì)數(shù)為（68.07±5.54），LOW組MVD計(jì)數(shù)為（51.98±2.46），HIGH組MVD計(jì)數(shù)為（38.32±5.03），CQ組MVD計(jì)數(shù)為（30.91±3.23）。EMs組、LOW組MVD計(jì)數(shù)均高于CTRL組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;HIGH組MVD計(jì)數(shù)低于LOW組和EMs組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

真核細(xì)胞通過(guò)利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)完成自噬，應(yīng)對(duì)環(huán)境改變。當(dāng)EMs異位病灶處于氧化應(yīng)激、炎癥等刺激下或患者雌、孕水平變化均可影響異位內(nèi)膜細(xì)胞的自噬活性[6-8]。

EMs具有侵襲、種植、轉(zhuǎn)移等與惡性腫瘤相似的特點(diǎn)，某些抑癌基因可能通過(guò)調(diào)節(jié)自噬參與EMs的發(fā)生發(fā)展[9]。Beclin 1既是抑癌基因，又是自噬的正向調(diào)控因子，在EMs病程中必不可少[10]。自噬能夠促進(jìn)腫瘤血管生成，機(jī)制是通過(guò)保護(hù)性自噬維持細(xì)胞內(nèi)代謝平衡和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，從而調(diào)控血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM）的形成[11]。自噬特異性基因Beclin 1參與了胃癌中VM的形成[12-13]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Beclin 1及VEGF在EMs異位病灶中高表達(dá)，MVD數(shù)量亦最大，提示自噬對(duì)血管生成有促進(jìn)作用。自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）聯(lián)合抗-VEGF在抑制視網(wǎng)膜新生血管中可能比單純抗-VEGF發(fā)揮更好的作用[14]。筆者應(yīng)用自噬抑制劑CQ同樣下調(diào)了異位病灶中VEGF的表達(dá)，與上述研究結(jié)果一致。

EMs的經(jīng)典治療為手術(shù)治療及術(shù)后長(zhǎng)期藥物治療[15]。除對(duì)癥治療及激素療法外，新的治療如抗血管生成等“源頭治療”在臨床已有應(yīng)用，包括血管生長(zhǎng)因子抑制劑，抗血管生成抑制劑等[16]。RA是天然維生素A的代謝產(chǎn)物，常用于治療某些細(xì)胞增殖性疾病（如白血病）和高VEGF表達(dá)的惡性腫瘤。RA及其下游途徑通過(guò)控制促血管生成或抗血管生成信號(hào)調(diào)控血管生成。在脈絡(luò)膜、大腦皮質(zhì)及肺，RA以血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）為靶點(diǎn)調(diào)控血管生成[17]。崔仁哲等[18]報(bào)道RA可抑制角膜新生血管中VEGF的表達(dá)而抑制新血管的形成。全反式維甲酸（ATRA）可降低食管癌細(xì)胞VEGF等的表達(dá)影響新生血管的生成[19]。RA針對(duì)EMs中血管的作用報(bào)道較少。筆者前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RA可誘導(dǎo)異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中自噬的發(fā)生，且與濃度呈正相關(guān)[20]。在本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，高濃度RA抑制Beclin1并下調(diào)VEGF表達(dá)，作用效果與自噬抑制劑CQ幾乎相等，表現(xiàn)出對(duì)血管生成的調(diào)控作用。

RA調(diào)節(jié)血管生成的機(jī)制尚不十分清楚，已有報(bào)道PI3K/Akt/mTOR是重要的調(diào)節(jié)VEGF 表達(dá)的信號(hào)通路[21]，周凡[22]發(fā)現(xiàn)atRA（全反式維甲酸）可顯著激活3T3-L1 前脂肪細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR 通路; 孫林[23]實(shí)驗(yàn)證明扶腎方可能通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路發(fā)揮抑制腹膜血管新生作用。RA對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥中自噬及血管生成調(diào)節(jié)作用的機(jī)制及內(nèi)在的相關(guān)性，有待進(jìn)一步

研究。

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（收稿日期：2021-04-26） （本文編輯：姬思雨）