大視場線掃描共聚焦全息顯微成像

縱浩天，張運海，王發民，繆 新

（1.中國科學技術大學生物醫學工程學院，安徽合肥230026；2.中國科學院蘇州生物醫學工程技術研究所江蘇省醫學光學重點實驗室，江蘇蘇州215163）

1 引 言

顯微鏡是人類觀察與探索微觀世界的重要工具，它在生物醫學和工業檢測等領域都發揮著重要的作用。然而，大部分細胞或生物組織的光學吸收系數很小，利用傳統顯微鏡觀察時需要對樣本進行染色或熒光標記處理，但這種處理往往會帶來光毒性和光污染，從而對細胞的活性產生不利的影響。針對這一問題，Zernike相襯（Phase Contrast，PC）顯微鏡和微分干涉（Differ?ential Interference Contrast，DIC）顯微鏡應運而生，為活細胞非標記成像研究提供了有效的手段［1-2］。它們基于光的衍射和干涉原理將樣本的相位差信息轉化為振幅信息，從而實現對無染色樣本的觀察。隨著光學顯微技術的發展，相位成像逐漸成為研究熱點，定量相位成像技術得到了長足的發展［3-11］。

20世紀50年代，Marvin Minsky發明了共聚焦顯微鏡，由于它能夠獲得高分辨率、高對比度的圖像和真正的光學切片，目前已經在工業檢查、生物和醫學領域得到廣泛應用［12-14］。然而，傳統的共焦顯微鏡采用基于強度的成像方式，這意味著丟失了樣品的相位信息。為了恢復相位信息，有研究者在共焦顯微鏡中采用了差分干涉法和電光相位調制法［15］。近年來，數字全息技術（Digital Holography，DH）作為一種新興的定量相位成像方式，在光學計量、生物學和醫學中得到了廣泛的研究和應用［16-18］。DH作為一種寬場成像方式，雖然可以實現數字重聚焦，但仍不能抑制離焦光來實現真正的光學切片。

共焦全息顯微鏡（Confocal Holographic Mi?croscopy，CHM）的概念 是由Herring在1997年［19-20］提出的，用于研究微重力下的流體。CHM在成像中需要一個非常復雜的光學系統，這使得它很難應用在其他領域。2012年，Goy等［21］將DH合并到點掃描共聚焦顯微鏡（Point-scanning Confocal Microscope，PCM）中，提出了一種數字點掃描共聚焦顯微鏡（Digital Point-scanning Confocal Microscope，DPCM），并于2013年［22］采集到生物樣品的相位圖。2014年，Schnell等［23］將合成光學全息術（Synthetic Optical Holography，SOH）與點掃描共聚焦成像系統結合，通過移動參考光束實現了同軸全息，完成了合成光學全息定量共焦相位成像。2016年，Liu初步驗證了線掃描共聚焦與DH結合的可行性［24］，在實驗中用分辨率板做測試，但并未使用生物樣本，實際應用中還存在問題，比如受光路系統和CCD或CMOS等光電傳感器件的陣列尺寸和像素總數的限制成像視場過小，環境振動會引起相位抖動橫紋等，從而限制了這種成像技術在大視場測量中的應用與推廣。

本文將線掃描共聚焦與離軸DH相結合，利用位移臺掃描獲取多條干涉線并合成二維共聚焦全息圖，采用頻域濾波法提取樣本的振幅與相位分布，實現線掃描共聚焦全息成像。采用多區域拼接法，在不影響分辨率的情況下擴大了線掃描共聚焦全息成像的視場；且利用相鄰剖面相似的特點校正了環境、機械振動等外部因素所造成的相位抖動橫紋問題，為相關儀器的研制提供了依據與指導。

2 方 法

線掃描共焦全息成像以DH為基礎，以高相干光源激光器作為光源（目前多為He-Ne激光器），邁克爾遜干涉儀或馬赫-曾德爾（Mach-Zehnder，M-Z）干涉儀作為基本光路框架，將高相干的激光分為兩路，分別為探測光和參考光，利用線探測光和線參考光發生干涉從而產生一維干涉條紋。干涉條紋包含了物體的振幅與相位信息。通過狹縫濾除非焦面雜散光，用CCD作為探測器記錄干涉條紋進而得到全息圖。

2.1 數字全息

在離軸數字全息的過程中，物光波與參考光波以一定的夾角在全息面上發生干涉并被CCD記錄下來。物光波的復振幅含有振幅和相位信息，但是CCD只能記錄強度信息，因此使用參考光與物光波發生干涉，使物光波的相位信息轉化為強度信息，即全息圖，于是相位信息便被記錄在干涉條紋中。后續的重建過程即從全息圖的條紋信息中將振幅與相位信息提取出來并處理。

圖1 離軸全息記錄示意圖Fig.1 Schematic diagram of off-axis holographic record?ing

定義到達CCD記錄面時物光波O(x，y)和參考光波R(x，y)的復振幅分別為：

式中：A1(x，y)和A2(x，y)分別是物光和參考光的振幅分布，φo(x，y)和φr(x，y)分別是物光和參考光的相位分布。CCD記錄面上的光強可以表示為：

將式（1）和式（2）中兩束光波的復振幅代入式（3）并化簡可得：

式（4）為全息圖的分布，前兩項表征的是物光波和參考光波的振幅；而第三項則是物光與參考光的干涉項，在全息圖中表現為干涉條紋的分布，包含物光的振幅和相位信息，并且分別受到參考光振幅和相位的調制。由于物光與參考光存在一定的夾角，引入了參考光的載頻，因此干涉得到的全息圖經傅里葉變換后，所得的空間頻譜圖的各干涉像相互分離，在全息圖衍射場中有0級和±1級干涉項。在濾波重建的過程中，需要消去+1級項中參考光的載頻，消去R*的方法可以表示為：

IR=(|R|2+|O|2)R+|R|2O+RRO*，（5）

式中，第一項為直透光或者零級像；第二項為+1級項或者原始像，包含物光的原始信息；第三項是產生畸變的共軛像，也稱為-1級項。在頻譜中將+1級項|R|2O單獨濾出，由于參考光一般為平面波，所以其振幅常作為常數忽略。一般情況下需要通過數值衍射的方式重建物光場，但線掃描共焦全息顯微成像利用的是像面全息，逆變換到空間域后無需進行衍射重建。強度與相位分布分別為：

2.2 線掃描共聚焦全息

2.2.1 光路結構

線掃描共焦全息顯微鏡是在線掃描共聚焦系統的基礎上，增加一路參考光，形成邁克爾遜干涉儀框架，如圖2所示。激光經擴束準直后，經柱面鏡CL單方向會聚，即一個方向為平行光，另一個方向會聚，目的是為了在最終樣本面形成一條焦線，后續需要利用這條焦線掃描成像。由分光棱鏡BS分光后，反射的一路為常規線掃描共聚焦光路，經物鏡在樣本面會聚成一條焦線，由位移臺控制樣本移動實現掃描（見圖4）。透射的參考光路中采用和探測光路中相同的結構，目的是為使兩路的光程差維持在光源的相干長度內，并且使參考光在CCD靶面上會聚成一條焦線，與物光的焦線發生干涉，生成共聚焦干涉線并由CCD記錄。為了實現一維離軸DH，在yoz平面內稍微傾斜分光棱鏡BS來引入一個離軸角。

圖2 線掃描共聚焦全息成像系統光路Fig.2 Optical path of line-scanning confocal holographic imaging system

2.2.2 處理過程

由線掃描共聚焦成像的結構可知，在探測端需要有狹縫濾除離焦光。本文采用的是虛擬狹縫，利用CCD的若干行像素寬度作為狹縫。優勢為后期數據處理時可以根據具體情況自由調節狹縫的寬度。具體公式如下：

式（8）的含義是將虛擬狹縫內的若干行像素對應相加作為當前第n行的像素值。虛擬狹縫的寬度為：

式中：λ為光源波長，M為系統放大倍數，NA為物鏡的數值孔徑，P為CCD的像素尺寸。

線探測光與線參考光干涉生成一維干涉線并由CCD記錄，隨著位移臺的移動掃描，CCD再記錄下一個位置的一維干涉線，以此類推。相對于針對每一條線都進行全息重建，分別提取振幅與相位然后生成二維圖［24］，本文采用式（8）和式（9）處理每條一維干涉線，然后合成二維全息圖，后續只需進行一次全息重建便可分別獲得振幅與相位圖，處理過程更加簡潔高效，處理流程如圖3所示。

圖3 圖像處理流程Fig.3 Flow chart of image processing

2.2.3 抖動校正

在位移臺掃描的過程中，由于干涉條紋很敏感，環境振動、機械振動可能會引起線上干涉條紋的整體抖動，導致不同線的條紋分布會出現錯位。而相位信息正包含在條紋分布中，這種錯位會引起相位的偏移。由于是線掃描，所以對于每一行的像素，其相位偏移值是相同的，利用相鄰行剖面相似的特性，采用下述步驟可以很大程度上校正抖動：

（1）用第2行像素的相位減去第1行對應像素的相位，然后對得到的結果取平均，得到第2行相對于第1行的相位偏移量?h1；

（2）第2行所有像素相位值都減去相位偏移量?h1；

（3）用第n+1行像素的相位減去第n行對應像素的相位，然后對得到的結果取平均，得到第n+1行相對于第n行的相位偏移量?hn；

（4）第n+1行減去相位偏移量?hn；以此類推，直至最后一行。

這是一種較為近似的算法，能很大程度上去除抖動所產生的橫紋，對于部分階躍型樣本可能存在較小的誤差，但在絕大多數情況下可以達到良好的效果。

2.3 大視場掃描拼接方法

受到線掃描共焦成像系統與CCD靶面尺寸的限制，無法同時滿足分辨率與視野的實際應用需求。為了解決這一問題，本文采用子圖拼接的方式，在保證CCD采樣分辨率的情況下獲取更大的成像視場。采用位移臺移動掃描的方法實現多幅子圖的采集，對采集的子圖拼接，達到大視場成像的目的，并且結構相對簡單。

圖4 子區域圖像采集的掃描路徑示意圖Fig.4 Schematic diagram of scanning path for image ac?quisition in sub region

在線掃描共焦全息顯微系統中，光源發出的光束通過系統后在樣本面形成一條焦線，利用位移臺控制樣本移動實現焦線對樣本的掃描，如圖4所示。根據重疊區域要求和單次成像區域大小確定位移臺沿X方向的位移量，位移臺每移動一個位置，控制位移臺沿Y方向移動掃描并采集一幅圖像。相比于其他拼接方式［16］，本文為了充分利用線掃描成像的優勢，使后續拼接過程更加高效與便捷，利用位移臺沿Y方向連續掃描出一矩形區域，使用矩形區域拼接的方式，過程如下：

（1）控制位移臺移動到某一待成像位置后，然后沿Y方向掃描一矩形區域，命名為A1，位移臺復位；

（2）控制位移臺沿X方向平移一固定步進，以步驟1中相同位移量控制位移臺掃描一矩形區域，命名為A2，位移臺復位；

以此類推，至最后一個子區域An，后續對A1～An做拼接處理。為了避免信息丟失，子區域之間需要有一定的重疊區域，重疊區域的大小可以根據沿X軸的視場，通過控制位移臺的步進調節。

常規拼接算法通常采用基于特征點的圖像配準方法去確定圖像之間的重疊區域，然后再進行拼接處理。但本文中重疊區域的大小可根據位移臺橫向步進值和子區域橫向視場的大小計算得到，所以直接進行拼接效率更高，拼接算法流程如圖5所示。

圖5 圖像拼接流程示意圖Fig.5 Flow chart of image splicing

根據圖像重疊部分的大小，將具有含有重疊區域的子區域分為非重疊區域和重疊區域，例如A與B、C與D。其中B與C為重疊區域，兩者疊加并平均可得重疊部分E圖，隨后將三部分A，E，D拼合，便可完成子區域拼接。多幅子區域圖像之間的拼接與上述相同。重疊區域的大小是根據位移臺橫向步進值和子區域橫向視場計算得到的，因此拼接精度取決于位移臺的位移精度。

3 實驗結果

線掃描共焦全息顯微鏡系統原理如圖2所示。光源選用He-Ne激光器，波長為632.8 nm；顯微物鏡放大倍數為10；探測器采用面陣CMOS（濱松flash 4.0 V2），像素數為2 048×2 048，像素尺寸為6.5μm×6.5μm，靶面尺寸約為13 mm，具有自定義工作區域的功能，本實驗采用的虛擬狹縫就是利用這一功能，工作在條狀區域下的采集速度可達7 894 frame/s。柱面鏡CL的焦距f=100 mm，透鏡L4的焦距f=100 mm，筒鏡為OLYMPUS X71顯微鏡內置，焦距為180 mm。L3的焦距f=300 mm，可以算得系統的總放大倍數為30。

局部狹縫內線干涉線如圖6所示。根據實驗系統的相關參數，由式（9）算得狹縫寬度約為8.9行像素，實驗中取整數8行，將面陣CMOS工作區域設置為2 048×8像素。首先對分辨率板進行成像，由以上過程合成整幅線掃描二維共聚焦全息圖，如圖7所示。

圖6 局部狹縫內的線干涉條紋Fig.6 Line interference fringes in local slit

以圖7（a）中的子區域A1為例，利用離軸全息重建算法，首先利用傅里葉變換得到其頻譜，可以看到-1級項、0級項、+1級項依次排布。根據全息重建原理，需要將+1級項單獨濾出并頻移到頻譜中心，利用傅里葉逆變換到空間域便可得到物光波復振幅，可以分別根據式（6）、式（7）提取物光的振幅與相位，如圖8所示。

圖7 合成二維共聚焦全息圖Fig.7 Synthesis of 2D confocal hologram

圖8 數據處理過程Fig.8 Demonstration of principle for operation and data processing

實驗中采用減去系統空采相位圖的方法去除系統的相位畸變。用離軸全息重建算法分別對子區域A1，A2，A3進行處理，提取出振幅和相位信息。其中相位圖中的橫紋是由于在位移臺掃描過程中，環境、機械振動引起的條紋抖動，導致最終重建出的線掃描共聚焦全息圖中的條紋產生了橫向上的微小錯位，使最終重建的相位圖中產生橫紋，符合前期的預測。用第二節中的方法來校正抖動所帶來的橫紋，效果如圖8（d）所示。圖9為圖8（c）中沿白線和8（d）中對應位置的剖面對比，校正前后對比效果明顯，計算方差可知本次實驗中抖動程度降低了約84.7%。

圖9 抖動校正前后對比Fig.9 Comparison before and after jitter correction

圖10 分辨率板成像拼接結果。（a）拼接后大視場振幅圖；（b）拼接后大視場相位圖；（c）局部放大；（d）（c）中沿虛線部分剖面；（e）與傳統線掃描共聚焦的軸向半高展寬對比Fig.10 Splicing results of the image of resolution plate.（a）Large field of view amplitude map after splic?ing；（b）Large field of view phase map after splicing；（c）Local magnification of red rectangle area in（a）；（d）Profile along the dashed red line in（c）；（e）Comparison of axial FWHM with tra?ditional line scanning confocal microscope（LCM）

對子區域重建后的圖像進行拼接處理，拼得大視場圖像如圖10所示。拼接所得的視場達1 160μm×1 043μm，本文采用線掃描共聚焦成像方式，所以根據圖像線掃描方向可分為共聚焦方向和非共聚焦方向，理論上共聚焦方向和非共聚焦方向有著不同的成像分辨率，共聚焦方向的成像分辨率要略高于非共聚焦方向［25］。根據圖10（d）可以看出，分辨率板第8組第6條可以分辨清楚，共聚焦方向分辨率高于2.19μm，非共聚焦方向可分辨第8組第4條，非共聚焦方向分辨率高于2.73μm。由此可見，線掃描共聚焦全息成像的分辨率符合傳統線掃描共聚焦顯微鏡的分辨率的規律。通過在物鏡焦面附近沿Z軸方向按相同步進值移動反射鏡，測量其成像總強度，然后繪制可得其歸一化強度曲線，如圖10（e）所示。測兩者的半峰全寬（Full Width Half Maxi?mum，FWHM）可知，線掃描共聚焦全息顯微鏡的軸向分辨率與傳統線掃描共聚焦顯微鏡相當。

圖11 為掃描洋蔥表皮細胞表面的結果。常見的動植物細胞直徑約為5～100μm，理論上本成像系統的分辨率足以對一般的生物細胞成像。這里以洋蔥表皮細胞為例，圖中細胞近似長方形，寬度約為60～100μm，長度約為150～300 μm。圖11（a）為線掃描共焦掃描并拼接所得的洋蔥細胞成像圖；圖11（b）為線掃描共焦全息重建并拼接所得的洋蔥細胞成像圖；圖11（c）為全息重建算法提取出的相位信息，利用最小二乘解包裹算法［26］解包裹處理后拼接所得的相位成像圖。

圖11 洋蔥細胞大視場成像拼接結果Fig.11 Image splicing results of onion cells with large field of view

4 結 論

本文采用線掃描共聚焦與離軸DH相結合的方法，將獲得的共聚焦干涉線合成二維共聚焦全息圖，采用頻域濾波法成功提取出分辨率板和洋蔥表皮細胞的相位信息，實現了基于共聚焦的定量相位成像。采用相鄰剖面相似的特性校正了由于環境或機械振動所造成的相位橫紋，使本實驗中重建所得相位圖的抖動程度降低了84.7%。并且提出了一種針對線掃描共聚焦全息成像的大視場成像系統，采用控制位移臺移動樣本掃描的方法達到對樣本的大范圍線掃描的目的，實現了對大視場子區域的采集與拼接，達到了大視場成像的目的。該系統通過控制位移臺掃描3個矩形并且有一定重疊區域的子區域進行拼接，在不影響成像分辨率的前提下獲得了1 160μm×1 043μm的大視場，并且采集更多子區域可以獲得更大的視場。它具有結構簡單、易于應用的優勢，可為相關儀器的研制提供參考。