納米β磷酸三鈣/水凝膠復合材料促進骨再生的實驗研究

徐人杰，馬進進，周曉強，虞 宵，顏勇卿，楊志杰，楊惠林，賽吉拉夫，陳廣祥

創(chuàng)傷、腫瘤、先天畸形、炎癥所致骨缺損臨床十分常見。目前修復骨缺損的方法主要包括自體骨移植、異體及異種骨移植、人工合成骨替代材料移植等。自體骨移植一直被認為是骨缺損修復的金標準[1]，因其來源有限，易造成取骨部位的繼發(fā)性損傷，臨床應用受到限制；異體及異種骨移植存在潛在免疫排斥及傳播疾病的風險。人工合成骨替代材料具有良好的生物學性能，是破解骨缺損難題的重要發(fā)展方向。

磷酸三鈣（tricalcium phosphate，TCP）主要由鈣、磷組成，其成分與骨基質(zhì)的無機成分相似，具有良好的生物相容性，目前在醫(yī)學中常用的是β-TCP。該材料降解較快，疲勞強度低，脆性大，因此限制了其在高負荷部位植骨的應用。甲基丙烯酸?；髂z（methacrylate gelatin，GelMA）是一種光敏性生物材料，配合光引發(fā)劑使用可在藍光或紫外光下迅速交聯(lián)固化，形成具有一定強度的三維結(jié)構(gòu)。其生物相容性優(yōu)異，可良好支持細胞的增殖及遷移，并可負載腫瘤細胞、心肌細胞、軟骨細胞等多種細胞。本研究將納米β-TCP與GelMA復合，探討復合水凝膠的生物相容性及其對骨再生的促進作用，為人工合成骨替代材料的選擇提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

GelMA 固體海綿、光引發(fā)劑苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰膦酸鋰（Sigma 公司，美國）；納米β-TCP（蘇州鼎安科技有限公司）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司，美國）；青霉素/鏈霉素（Sigma-Aldrich 公司，美國）；Percoll 細胞分離液（上海源葉生物科技有限公司）；1×PBS 緩沖液（Merck 公司，美國）；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性檢測試劑盒、RIPA 裂解緩沖液（上海碧云天生物科技有限公司）；CCK-8 細胞檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）。

E10000 萬能力學試驗機（instron 公司，美國）；細胞培養(yǎng)箱、生物安全柜（Thermo Fisher Scientific 公司，美國）；超低溫–80℃冰箱（海爾集團公司）；倒置熒光顯微鏡（Zeiss公司，德國）；掃描電鏡（Hitachi 公司，日本）；Micro-CT（Kontich 公司，比利時）；多功能酶標儀（Bio-TEK 公司，美國）；電子天平（上海天平儀器廠）；培養(yǎng)皿、細胞培養(yǎng)板、1.5 mL EP 管（Corning 公司，美國）；離心管（上海晶安生物科技有限公司）。

1.2 水凝膠制備

向0.5 g GelMA 固體海綿中加入10 mL PBS，置于37℃水浴鍋中溶解至透明狀液體，加入0.025 g光引發(fā)劑，溶解后得到質(zhì)量濃度為5%w/v的GelMA溶液（以下簡稱GelMA溶液）。取1 mL GelMA溶液滴于12孔培養(yǎng)板板孔中，以波長405 nm藍光光源照射1 min，得到固化GelMA 水凝膠備用。取200 mg納米β-TCP粉末加入1 mL GelMA溶液中，混勻后取1 mL混合溶液（質(zhì)量濃度為20%w/v）滴于12孔培養(yǎng)板的板孔中，以波長405 nm藍光光源照射1 min，得到固化的納米β-TCP/GelMA復合水凝膠備用。

1.3 實驗動物

清潔級健康SD 大鼠購自蘇州大學動物實驗中心[動物許可證號SCXK（蘇）2017-0006]，雌雄不限。

1.4 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）的提取和培養(yǎng)

參照文獻[2]方法取6 周齡SD 大鼠，斷頸處死，放入75%乙醇中浸泡10 min，無菌條件下離斷雙下肢，剔除附著肌肉和結(jié)締組織，取股骨和脛骨，切除骨兩端，以含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，得到骨髓細胞懸液。在懸液中加入等量PBS，以1 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min，棄上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基至5 mL，重懸。在15 mL離心管中預先加入10 mL密度為1.073 g/mL 的Percoll 細胞分離液，緩慢鋪上骨髓細胞懸液，以2 000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 min。抽取交界處白膜層細胞，加入2 倍體積PBS，以1 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心10 min，洗滌2 遍后，棄上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，接種于直徑15 cm 的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5 d 后換液，以后每2～3 天換液一次。當貼壁細胞融合至80%時，按1∶2 比例傳代。取生長狀態(tài)良好的第3代BMSCs備用。

1.5 細胞共培養(yǎng)及顱骨缺損大鼠模型分組實驗

根據(jù)共培養(yǎng)材料的不同分為空白對照組、GelMA 組、納米β-TCP/GelMA 組。按5×104個/孔的細胞濃度將BMSCs 種于12 孔培養(yǎng)板不同分組孔，每組加入1 mL 含有10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的α-MEM 完全培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基上加入0.5 mL 成骨誘導培養(yǎng)液（0.05 mmol/L維生素C、10 mmol/L β-磷酸甘油和100 mmol/L地塞米松），置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在不同時相點進行電鏡觀察、細胞增殖實驗和ALP 染色檢測。

取18 只8 周齡SD 大鼠，重量（250±50）g，參照文獻[3]方法制作顱骨缺損模型。鹽酸氯胺酮（100 mg/kg）聯(lián)合噻拉嗪（25 mg/kg）腹腔注射麻醉，令大鼠俯臥，固定頭部和四肢。于大鼠頭頂正中取縱行直切口，切開骨膜，以電動手術鉆鉆取直徑8 mm骨窗。無菌生理鹽水沖洗傷口，去除碎骨組織。將大鼠隨機分為3組，每組6只。其中空白對照組直接逐層縫合皮膚；GelMA組、納米β-TCP/GelMA 組分別將制備好的光固化GelMA 水凝膠和光固化納米β-TCP/GelMA 復合水凝膠（規(guī)格相同，均為直徑8 mm、厚度1 mm）填充于顱骨缺損處，然后逐層縫合皮膚。大鼠清醒后移至飼養(yǎng)房，按實驗動物飼養(yǎng)要求喂養(yǎng)。每天注射30 萬單位青霉素，連續(xù)3 d。術后4、8周每組各取3只動物，過量麻醉處死，取顱骨標本待用。

1.6 觀察指標

1.6.1 材料力學性能 納米β-TCP/GelMA水凝膠固化后，以萬能力學試驗機測量其抗壓強度，并與GelMA水凝膠組對比。

1.6.2 大鼠BMSCs形貌及增殖、成骨性能

1.6.2.1 電鏡觀察 材料表面培養(yǎng)BMSCs 48 h，以2.5%戊二醛固定，30%～100%乙醇梯度脫水，臨界點干燥，噴金鍍膜，掃描電鏡觀察材料表面BMSCs狀態(tài)。

1.6.2.2 細胞增殖實驗 采用CCK-8 法[4]觀察BMSCs 與材料共培養(yǎng)后的增殖情況。細胞共培養(yǎng)1、3、5 d，將種植于不同材料上的細胞充分消化、吹打、離心定容，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入10 μL CCK-8 工作液，37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育2.5 h。以多功能酶標儀在450 nm處測定吸光度值，每個樣品平行測試6次。

1.6.2.3 ALP 染色 細胞共培養(yǎng)7 d，將種植于不同材料上的細胞充分消化、吹打，接種于96 孔培養(yǎng)板，待細胞貼壁后行ALP染色。

1.6.3 大鼠顱骨缺損成骨情況

1.6.3.1 Micro-CT檢查Micro-CT掃描大鼠顱骨標本，觀察骨缺損區(qū)成骨情況。選擇感興趣區(qū)域計算骨量分數(shù)（bone volume/tissue volume，BV/TV）和骨密度（bone mineral density，BMD）。

1.6.3.2 組織學檢查 將標本浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，脫鈣，制備石蠟切片，常規(guī)行蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡下觀察骨缺損區(qū)域新骨形成情況。

1.7 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。CCK-8實驗中不同分組吸光度值、BV/TV和BMD比較進行方差分析，組間兩兩比較采用Student'st檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 材料力學性能比較

GelMA水凝膠組和納米β-TCP/GelMA水凝膠組的楊氏彈性模量分別為（36.3±2.2）、（44.8±4.0）kP（at=–3.192，P=0.033）。

2.2 3組大鼠BMSCs形貌、增殖及成骨性能比較

2.2.1 電鏡結(jié)果 大鼠BMSCs 與材料共培養(yǎng)48 h，其在GelMA 水凝膠和納米β-TCP/GelMA 水凝膠復合材料表面均有良好的貼附及鋪展（圖1），提示兩種材料均具有良好的生物相容性。

圖1 共培養(yǎng)48 h大鼠BMSCs在材料表面貼附和鋪展的掃描電鏡圖片1A GelMA水凝膠材料1B 納米β-TCP/GelMA水凝膠材料（×3 000）

2.2.2 CCK-8 檢測結(jié)果 如圖2 所示，3 組大鼠BMSCs與材料共培養(yǎng)1、3、5 d，細胞數(shù)量隨時間推移而不斷增加；共培養(yǎng)3、5 d時，3組中納米β-TCP/GelMA組OD值最高，與其他兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示其可顯著促進細胞增殖，為細胞提供良好的生長條件。

圖2 大鼠BMSCs與各組材料共培養(yǎng)不同時相點OD值（*兩組比較，P ＜0.05）

2.2.3 ALP染色 大鼠BMSCs 與材料共培養(yǎng)7 d的ALP染色結(jié)果如圖3所示，與GelMA組相比，納米β-TCP/GelMA 組ALP 表達明顯增強，提示其具有優(yōu)異的體外促成骨性能。

圖3 大鼠BMSCs與各組材料共培養(yǎng)7 d堿性磷酸酶染色

2.3 3組大鼠顱骨缺損區(qū)成骨情況比較

2.3.1 Micro-CT 檢查 術后4 周，空白對照組骨缺損邊緣較模糊，有少量新生骨；GelMA組骨缺損邊緣有散在新生骨；納米β-TCP/GelMA 組骨缺損面積顯著減小，新生骨連接成片。術后8周，空白對照組骨缺損邊緣較模糊，有少量新生骨；GelMA組骨缺損邊緣有新生骨連接成片狀；納米β-TCP/GelMA 組骨缺損面積顯著減小，骨缺損中央?yún)^(qū)域有大片狀新生骨（圖4）。

圖4 3組大鼠顱骨缺損區(qū)術后4、8周Micro-CT

3 組4、8 周BV/TV、BMD 見圖5 和圖6，從低到高分別為空白對照組、GelMA 組、納米β-TCP/GelMA 組，納米β-TCP/GelM 組與空白對照組及GelMA組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖5 3 組大鼠顱骨缺損區(qū)術后4、8 周骨量分數(shù)（*兩組間比較，P ＜0.05）

圖6 3組大鼠顱骨缺損區(qū)術后4、8周骨密度（*兩組間比較，P ＜0.05）

2.3.2 組織學檢查 術后4周，空白對照組骨缺損內(nèi)充滿大量纖維組織；GelMA 組骨缺損邊緣有少量紅色新骨生成，其內(nèi)分布少量新生毛細血管；納米β-TCP/GelMA組骨缺損周圍有較多紅色新骨和新生血管形成。術后8周，空白對照組缺損內(nèi)依然充滿大量纖維組織，邊界有少量紅色新骨；GelMA組骨缺損可見較細長的紅色新骨；納米β-TCP/GelMA組骨缺損中間區(qū)域有豐富的紅色新骨及微血管網(wǎng)絡（圖7）。

圖7 3組大鼠顱骨缺損區(qū)術后4、8周組織學觀察（蘇木精-伊紅染色，黃色箭頭標記為紅色新骨，上圖為×25，下圖為×100）

3 討論

1920 年，Albee 和Morrison[5]首次將磷酸鈣材料用于骨修復。一個世紀過后，磷酸鈣材料已廣泛應用于牙科、口腔頜面外科和骨科領域，包括牙周缺損修復，創(chuàng)傷、炎癥、骨腫瘤所致骨缺損修復以及脊柱融合[6-11]等。既往認為，磷酸鈣材料僅具有骨傳導性，但近期研究表明，某些磷酸鈣材料具有骨誘導性[12]。在體內(nèi)，磷酸鈣材料多孔和粗糙的結(jié)構(gòu)可以捕獲和富集骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）等骨誘導因子和骨祖細胞；而磷酸鈣材料上形成的碳酸鹽磷灰石層則有助于蛋白質(zhì)黏附和骨祖細胞附著、增殖、分化并產(chǎn)生細胞外基質(zhì)，最終導致生物礦化或骨骼形成[13]。

TCP可根據(jù)結(jié)構(gòu)分為α-TCP 和β-TCP，因α-TCP 降解速度過快，骨缺損修復主要采用β-TCP。其在水中可部分溶解，產(chǎn)生鈣磷離子后被人體吸收，是構(gòu)成骨骼的主要原料。缺點在于強度低，韌性差，影響其在負重區(qū)域的植骨應用。

RGD序列是廣泛存在于細胞外基質(zhì)中的氨基酸序列，為11種整合素配體提供識別位點，在細胞黏附、生長中發(fā)揮重要作用。明膠是膠原的降解產(chǎn)物，富含RGD 序列，具有良好的組織相容性和生物活性。然而，明膠機械強度差，降解速度快，與骨組織修復速度不匹配。2000 年Van den Bulcke 等[14]利用甲基丙烯酸酐取代明膠側(cè)鏈氨基團，借助紫外線照射水溶性光引發(fā)劑，啟動自由基聚合交聯(lián)明膠，成功獲得GelMA。與明膠相比，GelMA 水凝膠機械強度增加，降解性能改善[15]。Benton 等[16]構(gòu)建用于培養(yǎng)主動脈瓣間質(zhì)細胞的GelMA 支架，取得良好效果；亦有學者將GelMA水凝膠作為構(gòu)建組織工程軟骨的生物材料，用于骨科手術[17]；GelMA 還可支持角質(zhì)形成細胞的生長、分化和分層，成為具有屏障功能的表皮[18]。

本研究基于GelMA 水凝膠構(gòu)建骨組織工程三維微環(huán)境，有利于細胞黏附。電鏡結(jié)果顯示，BMSCs 在GelMA 水凝膠和納米β-TCP/GelMA 水凝膠復合材料表面均有良好的貼附及鋪展，生物相容性良好；CCK-8 測試結(jié)果則表明，添加納米β-TCP 后，可增強GelMA 水凝膠的促細胞增殖能力，這一結(jié)果與既往文獻報道相符[19]。

成骨細胞分化過程中分泌的ALP是早期骨形成的標志物，ALP 染色可反映成骨細胞活性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，納米β-TCP/GelMA 組ALP 染色強于GelMA 組、空白對照組，提示納米β-TCP/GelMA水凝膠可進一步促進成骨細胞分化。大鼠顱骨缺損區(qū)Micro-CT 和組織學檢查結(jié)果亦證實，納米β-TCP/GelMA 水凝膠能夠顯著促進成骨，其具有協(xié)同增強骨再生能力的作用，這與Fang 等[20]GelMA 水凝膠支架進一步促進成骨的作用相仿。與此同時，納米β-TCP/GelMA 水凝膠為軟膏狀可注射骨修復材料，光固化前可任意塑形，光固化后具有更好的維持形態(tài)能力，不易被體液沖散，便于操作，實用性強，適于填充不規(guī)則形的骨缺損區(qū)域。但力學測試結(jié)果顯示，納米β-TCP/GelMA 水凝膠復合材料抗壓強度較低，只能用于非負重區(qū)域的植骨。未來針對這一問題，將在材料學方面進一步深入研究，力爭開發(fā)出力學性能更強的人工合成骨替代材料。