南昌白豬大腸桿菌的分離鑒定及體外抑菌試驗

李歡，黃婧文，梁潤利，萬樂，吳晨曉，張羿洋，肖芬，萬振鵬，朱芝秀

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌330045）

大腸桿菌普遍存在于人和動物的腸道內(nèi)，是一種常見的人畜共患病條件型致病菌[1]，某些血清型致病性的大腸桿菌及其毒素可引起的白豬大腸桿菌病[2],是危害仔豬生長發(fā)育的主要疫病之一[3],該病主要表現(xiàn)為腸系膜淋巴結(jié)腫大、充血；心、肝、腎有不同程度的變性和小的凝固性壞死灶[4]。2020 年10月，江西省某養(yǎng)豬場一頭白豬因腹瀉死亡。對疑似大腸桿菌感染的病例進行臨床解剖。對從病變內(nèi)臟中分離出的細菌進行鑒定和體外抑菌試驗，探討對該病有效的防治方法

1 材料

1.1 病料和試驗動物

病料：江西省某豬場患病死亡豬。實驗小白鼠：20g 左右，南昌大學(xué)動物養(yǎng)殖室提供。

1.2 試驗試劑及器材

NA 培養(yǎng)基、EMB 培養(yǎng)基、MACC 培養(yǎng)基、TSI 培養(yǎng)基，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；5%兔血培養(yǎng)基，自行配制；藥敏試紙、腸桿菌生化鑒定微量管，購自杭州天和微生物有限公司；牛津杯，購自上海申源科學(xué)儀器有限公司；數(shù)顯游標卡尺，購自上海上工儀器有限公司；超凈工作臺，購自蘇州凈化集團。

1.3 試驗用菌

乳酸菌 T-C-7-R1、T-C-7-R2、T-C-7-R3：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實驗室保存。

2 方法

2.1 細菌分離鑒定

2.1.1 臨床診斷。觀察心、肺、肝器官的病變情況；觀察腸系膜淋巴結(jié)、各腸段的病變情況。截取脾臟、肺、小腸等器官的病變部位進行瑞氏染色鏡檢。

2.1.2 分離培養(yǎng)。從豬脾臟、小腸、肺等病變部位中勾取病料，接種于5%的兔血平板，37℃培養(yǎng)24h后，篩選單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢，察看細菌在油鏡下的整體外形；純化接種在普通瓊脂培養(yǎng)基上,獲得分離菌 D2、D3、D4；將 D2、D3、D4 進行鑒別培養(yǎng)，分別在EMB 培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、TSI 瓊脂斜面培養(yǎng)基上劃線接種后于37℃培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)。

2.1.3 生化鑒定。將D2、D3、D4 分別接種于腸桿菌科的生化鑒定微量管中，37℃培養(yǎng)24～48h，觀察反應(yīng)，加入生化反應(yīng)指示劑。對結(jié)果進行記錄和分析。

2.2 體外抑菌試驗

2.2.1 藥敏試驗。依據(jù)紙片擴散法[5]，無菌操作將D2、D3、D4 接種于普通肉湯中，37℃培養(yǎng) 24h，將發(fā)酵液均勻涂布于EMB 培養(yǎng)基上，藥敏紙片按序貼于培養(yǎng)基表面，記錄藥敏紙片藥物名稱，在37℃恒溫箱中靜置24h，觀察并記錄結(jié)果，游標卡尺測量抑菌圈的直徑。

2.2.2 乳酸菌體外抑菌試驗。按照牛津杯擴散法，無菌條件下將 D2、D3、D4 接種普通肉湯，37℃靜置培養(yǎng)24h，均勻涂抹于EMB 培養(yǎng)基表面，等距將牛津杯放置在平板上，將T-C-7 培養(yǎng)液用注射器緩慢注入牛津杯，置4℃冰箱待乳酸菌全部擴散后，正放于37℃溫箱培養(yǎng)24h 后，測量記錄抑菌圈大小。

2.3 動物試驗

無菌條件下，將D2、D3、D4 接種于普通肉湯，37℃培養(yǎng)24h 備用。將適應(yīng)環(huán)境一周后的實驗小白鼠隨機分為4 組（4 只/組）。3 組試驗組分別腹部注射 D2、D3、D4 發(fā)酵液（0.5mL/只），1 組對照組用同樣方式注射等量生理鹽水。每天觀察記錄小白鼠的發(fā)病情況，具備典型病狀的死亡小白鼠進行細菌分離鑒定。

3 結(jié)果

3.1 臨床診斷結(jié)果

肺纖維素滲出（圖1），腹股溝淋巴結(jié)大理石樣變（圖2），腸淋巴結(jié)腫大（圖3），取豬肺病變部位進行瑞氏染色油鏡觀察，為兩端鈍圓的直桿型菌（圖4）。

3.2 分離培養(yǎng)結(jié)果

圖1 肺纖維素滲出

圖2 腹股溝淋巴結(jié)大理石樣

圖3 腸淋巴結(jié)腫大

圖4 瑞氏染色結(jié)果

D2、D3、D4 菌落在5%兔血平板上中等大小不溶血，EMB 培養(yǎng)基上閃現(xiàn)金屬光澤（圖5），麥康凱培養(yǎng)基上呈粉紅色（圖6）；TSI 斜面培養(yǎng)基無黑色沉淀（圖7），經(jīng)過革蘭染色鏡檢，為G- 直桿菌（圖8）。

圖5EMB 菌落

圖6 麥康凱菌落

圖 7TSI 瓊脂

圖 8 染色結(jié)果（10×100）

3.3 生化鑒定結(jié)果

D2、D3、D4 生化結(jié)果見表1，分離菌靛基質(zhì)試驗呈陽性；發(fā)酵木糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不能分解棉子糖和側(cè)金盞花醇，MR 陽性，VP 陰性。

表1 生化試驗結(jié)果

3.4 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果見表2，對頭孢曲松高度敏感，對氨芐西林等完全耐藥。

表2 藥敏試驗結(jié)果 mm

3.5 乳酸菌抑菌試驗結(jié)果

抑菌試驗結(jié)果見表 3，乳酸菌對 D2、D3、D4 有明顯的抑制效果

表3 乳酸菌體外抑菌實驗結(jié)果 mm

3.6 動物致病性試驗

試驗組小白鼠一周之內(nèi)，出現(xiàn)拉稀的現(xiàn)象，體型逐漸消瘦。對照組的生理狀態(tài)正常。分離典型病變小鼠肝臟中的病原菌，染色鏡檢結(jié)果與原分離菌形態(tài)一致。

4 分析討論

4.1 菌種分析

根據(jù)D2、D3、D4 的培養(yǎng)特點、鏡檢結(jié)果和生化特性，通過比對《Bergey＇s Manual of Systemaic Bacteriology》[6]，確定 D2、D3、D4 為大腸埃希氏菌。

4.2 臨床癥狀和生化特性

本次病例臨床診斷結(jié)果與病理解剖結(jié)果與姚淑紅報道的大腸桿菌病臨床診斷一致[7]，D2、D3、D4生化特性與徐海生發(fā)表的實驗結(jié)果一致[8]。

4.3 體外抑菌試驗分析

分析藥敏試驗結(jié)果可知，分離菌對頭孢曲松高敏，但對氨芐西林等耐藥[9]，與孫曉莉，陳敏卿等發(fā)表的論文結(jié)果有部分不符[10～11]，可能是地區(qū)用藥習(xí)慣不同造成[12]。體外抑菌試驗結(jié)果證明乳酸菌對大腸桿菌有較強的抑制作用，與易力、陸克文等發(fā)表的論文結(jié)果一致[13～14]，乳酸菌可配合抗生素使用[15]。

近年來我國養(yǎng)豬業(yè)的規(guī)模化發(fā)展,白豬大腸桿菌的發(fā)生與流行有明顯增加的趨勢[16]。養(yǎng)殖場應(yīng)該加強防范，科學(xué)管理，以防范為主，定時消毒、通風(fēng)，保證豬場的衛(wèi)生良好。治療可用肌肉注射頭孢類抗生素并飼料中添加的乳酸菌配合以增強療效。一旦發(fā)現(xiàn)病豬應(yīng)立即隔離，謹防傳染。