仔豬溶血性葡萄球菌的分離鑒定及體外抑菌試驗(yàn)分析

黃婧文，李歡，萬(wàn)振鵬，肖芬，張羿洋，吳晨曉，萬(wàn)樂(lè)，梁潤(rùn)利，朱芝秀

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌330045）

葡萄球菌是一種圓形或卵圓形的革蘭氏陽(yáng)性球菌，呈葡萄狀，無(wú)鞭毛，無(wú)莢膜，不產(chǎn)生芽孢[1]。臨床上，葡萄球菌病主要是由金黃色葡萄球菌引起的家畜的一種急性或慢性傳染病[2～3]，表現(xiàn)為畜禽急性、敗血性的一類(lèi)疾病[4]，牛雞鴨豬兔等均有可能感染該病[5～9]，發(fā)病急且迅速，并造成畜禽短時(shí)間內(nèi)死亡[3]。2020 年 10～11 月間，南昌某豬場(chǎng)爆發(fā)疑似葡萄球菌病例，本試驗(yàn)旨在通過(guò)對(duì)疑似病例進(jìn)行病理剖解及細(xì)菌分離鑒定等操作，對(duì)仔豬溶血性葡萄球菌的防治提供有效建議與科學(xué)方法。

1 試驗(yàn)材料

1.1 病料和試驗(yàn)動(dòng)物

病料：江西省某豬場(chǎng)患病死亡仔豬；小白鼠：南昌大學(xué)動(dòng)物室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及器材

普通瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；藥敏試紙、微量發(fā)酵管，購(gòu)自杭州天和微生物有限公司；牛津杯，購(gòu)自上海申源科學(xué)儀器有限公司；數(shù)顯游標(biāo)卡尺，購(gòu)自上海上工儀器有限公司；超凈工作臺(tái)，購(gòu)自蘇州凈化集團(tuán)

1.3 實(shí)驗(yàn)用菌

乳酸菌：由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)教研室提供。

2 試驗(yàn)方法

2.1 細(xì)菌分離鑒定

2.1.1 病理檢查。臨床解剖：觀(guān)察皮膚、黏膜等組織出血情況；觀(guān)察心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)等器官病變情況。

2.1.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)。無(wú)菌操作取死亡豬心、肝、關(guān)節(jié)液等病料，劃線(xiàn)接種5%兔血平板，置37℃溫箱培養(yǎng)24h，觀(guān)察優(yōu)勢(shì)菌落形態(tài)、大小、溶血等狀況；接種環(huán)無(wú)菌勾取單個(gè)典型菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，觀(guān)察菌體形態(tài)及排列狀況；勾取鏡檢菌落再次接種5%兔血平板，直至得到純分離菌ZGP-1、ZGP-2、ZGP-3。

2.1.3 細(xì)菌生化鑒定。將 ZGP-1、ZGP-2、ZGP-3 分別接種于生化微量管中，于37℃培養(yǎng)24 ～48 h，根據(jù)微量生化反應(yīng)說(shuō)明書(shū)，觀(guān)察反應(yīng)變化，分析并記錄結(jié)果。

2.2 細(xì)菌體外抑菌試驗(yàn)

2.2.1 藥敏試驗(yàn)。依據(jù)紙片擴(kuò)散法[11]，在無(wú)菌條件下，將 ZGP-1、ZGP-2、ZGP-3 接種于普通肉湯中，置于37℃恒溫培養(yǎng) 24h 后，將 ZGP-1、ZGP-2、ZGP-3 發(fā)酵液涂抹普通瓊脂培養(yǎng)基表面，用眼科鑷夾取藥敏紙片分別輕貼涂抹后的培養(yǎng)基，記錄藥敏紙片名稱(chēng)及放置順序，37℃靜置培養(yǎng)24h，觀(guān)察抑菌情況，游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑。

2.2.2 乳酸菌對(duì)分離菌體外抑制試驗(yàn)。在無(wú)菌條件下，將 ZGP-1、ZGP-2、ZGP-3 接種于普通肉湯中，37℃靜置培養(yǎng) 24h。將 ZGP-1、ZGP-2、ZGP-3發(fā)酵液均勻涂布普通瓊脂平板，其上等距離放置牛津杯，將乳酸菌培養(yǎng)液緩慢注入牛津杯，置4℃冰箱擴(kuò)散過(guò)夜后，于37℃培養(yǎng)24h，測(cè)量抑菌圈大小。

2.3 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

在無(wú)菌條件下，將 ZGP-1、ZGP-2、ZGP-3 接種于普通肉湯，37℃培養(yǎng)24h 備用。待小白鼠適應(yīng)一周后，隨機(jī)分為4 組（4 只/組）。3 組試驗(yàn)組分別腹注射 ZGP-1、ZGP-2、ZGP-3 發(fā)酵液（0.5mL/只），1組對(duì)照組同樣方式注射等量生理鹽水。每日觀(guān)察記錄小白鼠的發(fā)病情況，對(duì)具有典型病狀的小白鼠進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

3 結(jié)果

3.1 臨床檢查結(jié)果

腸系膜出血，淋巴結(jié)腫大（圖1）；胃內(nèi)外膜出血（圖 2）；關(guān)節(jié)積液明顯（圖 3）；肺水腫、出血（圖 4）；心肌出血（圖 5）；肝、膽囊出血（圖6）。

圖1 腸系膜出血、淋巴結(jié)腫大

圖2 胃內(nèi)外膜出血

圖3 關(guān)節(jié)積液

圖4 肺水腫、出血

圖5 心肌出血

圖6 肝、膽囊出血

3.2 病原菌分離培養(yǎng)結(jié)果

ZGP-1、ZGP-2、ZGP-3 菌落在 5%兔血平板上均呈透明的β 溶血（圖7），經(jīng)革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陽(yáng)性球菌，呈葡萄狀（圖8）。

圖7 透明的β 溶血

圖8 革蘭氏陽(yáng)性球菌

3.3 細(xì)菌生化試驗(yàn)結(jié)果

由表 1 可知：ZGP-1、ZGP-2、ZGP-3 可分解葡萄糖等五主糖，均產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。

表1 分離菌生化特性

3.4 分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

由表 2 可知，ZGP-1、ZGP-2、ZGP-3 對(duì)頭孢曲松、頭孢唑啉高度敏感，對(duì)鏈霉素、甲氧嘧啶、強(qiáng)力霉素、乙酰螺旋霉素等耐藥。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 mm

3.5 乳酸菌對(duì)分離菌體外抑制試驗(yàn)結(jié)果

乳酸菌 T-12C-5、T-12C-7、T-12C-11 對(duì) ZGP-1、ZGP-2 抑制作用不明顯，但對(duì)ZGP-3 有明顯抑制作用。

表3 乳酸菌對(duì)分離菌體外抑制試驗(yàn)結(jié)果 mm

3.6 動(dòng)物致病性結(jié)果

試驗(yàn)組小白鼠一周之內(nèi)，體形逐漸消瘦，腹部均有皮膚潰爛，呈現(xiàn)化膿性炎癥。對(duì)照組生理狀態(tài)正常。從典型病變小鼠肝臟中，分離到形態(tài)一致的細(xì)菌，染色鏡檢結(jié)果與原分離菌一致，均為葡萄狀革蘭氏陽(yáng)性球菌。

4 討論

4.1 菌種分析

比對(duì)病理剖檢、培養(yǎng)特性、生化試驗(yàn)等結(jié)果，參照《伯杰氏細(xì)菌分離鑒定手冊(cè)》[11]，可確診3 株分離菌均為金黃色葡萄球菌。

4.2 臨床癥狀分析

分離菌臨床剖解結(jié)果與林麗萍等發(fā)表的論文部分一致[12]，都引起關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎等癥狀。

4.3 生化試驗(yàn)分析

生化反應(yīng)結(jié)果與劉金章報(bào)道的病例基本相同[13]，vp 試驗(yàn)結(jié)果與王光鋒報(bào)道的病例不同[14]，可能與菌株差異有關(guān)。

4.4 體外抑菌試驗(yàn)分析

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌對(duì)頭孢曲松、頭孢唑啉高敏，對(duì)鏈霉素、強(qiáng)力霉素、環(huán)丙沙星、林可霉素等耐藥，與李淑紅[15]、蔣文賢等發(fā)表的論文結(jié)果不符[16]，可能與各地區(qū)用藥習(xí)慣有關(guān)。

乳酸菌體外抑菌結(jié)果表明，乳酸菌對(duì)分離菌均有一定的抑制作用，與彭珍發(fā)表的論文結(jié)果一致[17]，但對(duì)ZGP-1、ZGP-2 抑制作用不明顯，對(duì)ZGP-3 有明顯抑制作用，這可能是試驗(yàn)操作失誤造成的，比如培養(yǎng)基厚度、干濕不同，引起乳酸菌擴(kuò)散不均，造成抑菌圈大小懸殊。

4.5 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

試驗(yàn)小白鼠腹部皮膚均出現(xiàn)化膿性炎癥，懷疑分離菌是由于仔豬相互攻擊，從皮膚傷口入侵并致病，也可能存在耐藥基因引起多發(fā)。

5 防控措施

隨著畜牧業(yè)的快速發(fā)展，金黃色葡萄球菌病作為一種易發(fā)病應(yīng)當(dāng)?shù)玫街匾暋ｐB(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，保持圈舍衛(wèi)生，定期進(jìn)行消毒，做好免疫預(yù)防。一旦發(fā)現(xiàn)發(fā)病個(gè)體，應(yīng)立即隔離，圈舍消毒，防止更大范圍的感染。同時(shí),由于各種抗生素在豬場(chǎng)廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致金黃色葡萄球菌耐藥性污染逐年增加,致使金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的病害預(yù)防和治療難度加大[16]，在用藥方面可采用頭孢曲松等高敏藥物配合乳酸菌使用，追求合理配藥，避免長(zhǎng)期使用某一種抗菌藥物,遵循交叉用藥、輪換用藥和配伍用藥的原則,警惕抗生素的濫用現(xiàn)象[18]。