Neuregulin-1/ErbB信號通路在組織工程中作用的研究進展

李 玲，葛少華

神經(jīng)調節(jié)蛋白-1(neuregulin-1, NRG-1)在結構上從屬于表皮生長因子家族[1-3]。NRG-1包含一個位于蛋白質胞外結構域的表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)樣結構域，這個結構域可以激活受體[4-5]。紅細胞白血病病毒致癌基因同源物(erythroblastic leukemia viral oncogene homolog, ErbB)受體蛋白是一種跨膜蛋白，有4個亞型：ErbB1、ErbB2、ErbB3、ErbB4[6]。NRG-1與ErbB結合后，激活下游的信號分子，會發(fā)生一系列生物學效應[7-9]。本文將就NRG-1/ErbB信號通路在組織工程中的作用和機制作一綜述。

1 NRG-1/ErbB信號通路概述

NRG-1與ErbB受體的胞外段結合，招募效應分子[10-11]，導致信號傳遞到它們的傳感器，ErbB受體經(jīng)過誘導形成ErbB2/ErbB2或ErbB4/ErbB4同源二聚體，還可以形成ErbB2/ErbB4異源二聚體，繼而激活含有酪氨酸激酶的胞內(nèi)段，使其酪氨酸自身磷酸化，激活下游的磷脂肌醇-3-激酶(phosphatidylinositide-3 kinase, PI3K)-蛋白激酶B (protein kinase B, PKB/Akt)通路和絲裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節(jié)激酶(MAPK/ERK kinase, MEK)-細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal -regulated kinase, ERK)[12]。已知能被NRG-1激活的其他下游激酶，包括氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase, JNK)、細胞周期依賴性蛋白激酶5(cell cycle-dependent kinases 5, CDK5)和富脯氨酸蛋白酪氨酸激酶2(protein-rich tyrosine kinase 2, Pyk2)[13-15]。因此，NRG-1刺激可以激活經(jīng)典表皮生長因子(epidermal growth factor, EGF)信號通路，如：氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)、Src家族激酶和磷脂酶Cγ(phospholipase Cγ, PLCγ)[16](圖1)。

圖1 NRG-1/ErbB促進細胞增殖、遷移、抗凋亡及抗炎作用的機制圖Fig.1 The mechanism of NRG-1/ErbB promoting cell proliferation, migration, anti-apoptosis and anti-inflammatory effect

2 NRG-1/ErbB調控細胞增殖、遷移、抗凋亡的作用及機制

組織工程旨在修復受損的組織和器官，募集大量的干細胞，可有效地為組織工程解決干細胞來源的問題[17]。在心臟組織工程中，NRG-1和胰島素生長因子-1(insulin-like growth factor-1, IGF -1)聯(lián)合應用，NRG-1刺激細胞氧化磷酸化正向協(xié)同促進人胚胎干細胞的增殖[18]。由于NRG-1的缺失,突變小鼠(NRG-1flox;flox；Cyp19a1Cre 小鼠)嬰兒睪丸間質細胞的增殖顯著降低[19]，進一步反向驗證NRG-1的促增殖作用。外源性加入NRG-1通過增強其受體ErbB2、ErbB3和ErbB4的磷酸化促進了人冠狀動脈平滑肌細胞的增殖和遷移[20]。應用PI3K、ErbB2、ErbB3抑制劑證實NRG-1β能通過與ErbB受體結合激活PI3K/AKT通路，從而增強細胞的增殖和生存能力[21]。

在骨膠原缺陷小鼠體內(nèi)敲低ErbB3，降低施萬細胞前體的遷移能力，從而導致神經(jīng)軸突周圍的施萬細胞前體完全喪失，神經(jīng)束形成受損，神經(jīng)元細胞死亡[22]。在神經(jīng)退行性變的細胞模型中，NRG-1通過ErbB2/Akt對神經(jīng)元起到保護作用，而且不影響細胞的增殖和遷移，這些特性使其有可能成為潛在的神經(jīng)保護劑[23]。ErbB4在NRG-1刺激后激活Akt的磷酸化，賦予神經(jīng)元祖細胞高度的遷移活性，從而證實NRG-1及ErbB4在神經(jīng)元發(fā)育和成年期的遷移控制中起關鍵作用[24]。

在抗凋亡作用中，NRG-1β用于治療糖尿病心肌梗死大鼠，能夠減輕大鼠的心肌纖維化，降低心肌細胞的凋亡率。NRG-1通過抑制心肌細胞凋亡減輕了Ⅰ型糖尿病心臟梗死衰竭的進展[25]。ErbB4受體在人和小鼠結腸炎中高水平表達，并在促炎細胞因子存在的情況下抑制結腸上皮細胞凋亡[26]。體外研究表明，rNRG-1β能以劑量依賴性的方式提高大鼠脊髓運動神經(jīng)元的生存率。體內(nèi)研究表明，rNRG-1β改善屈肘功能的恢復，促進了脊髓運動神經(jīng)元的生存，提高肱二頭肌的神經(jīng)再生，減少肌肉萎縮[27]。

綜上所述，NRG-1/ErbB系統(tǒng)通過PI3K/Akt通路促進多種細胞增殖、抗凋亡為組織工程募集大量有效的種子細胞提供強有力的支持。NRG-1/ErbB可以有效促進細胞遷移，但具體的促遷移機制還有待進一步深入研究。

3 NRG-1/ErbB的免疫調節(jié)和抗炎作用

在組織工程中，已經(jīng)證實組織的再生需要擁有特定的臨床條件包括降低組織炎癥，有效控制細菌感染[28-29]。

在免疫調節(jié)方面，NRG-1誘導巨噬細胞向抗炎型(anti-inflammatory macrophages, aiMac)極化，但是未完全抑制向促炎型(pro-inflammatory macrophages, piMac)極化[30]。在單核細胞中，NRG-1/ErbB能通過激活PI3K/Akt降低脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導的單核細胞中腫瘤壞死因子 (tumor necrosis factor, TNF)-α的表達水平[31]。

在腦缺血/再灌注大鼠模型中，NRG-1β抑制金屬基質蛋白酶-9(metal matrix protease-9, MMP-9)的激活和炎癥的發(fā)展，改善神經(jīng)元生存的微環(huán)境，進而延遲不可逆階段的神經(jīng)元壞死[32]。通過計算機生物信息學，在體外觀察對腦缺血和小膠質細胞炎癥反應的調節(jié)可見NRG-1通過核因子κ-活化B細胞(nuclear factor kappa activated B cells, NF-κB)的光鏈增強劑通路顯著抑制LPS導致的TNF-ɑ和釋放白細胞介素-6 (interleukin, IL-6)。在腦梗成年SD大鼠，NF-κB通路磷酸化促進P65(Rel A)、P50(NF-κB1)轉移，分泌促炎因子，NRG-1通過降低IkB激酶(IkB kinase, IKK)磷酸化水平從而降低P65、P50轉移來發(fā)揮抗炎作用[33-34]。局灶性缺血會導致促炎細胞因子的釋放，NRG-1可使活化的大型噬菌體中炎癥基因的下降50%或更多[35]。SD大鼠腦卒中模型中，NRG-1阻止巨噬細胞/小膠質細胞浸潤和星形細胞活化后產(chǎn)生的局灶性缺血，并且通過抑制促炎反應，保護神經(jīng)元免于缺血引起的皮質細胞凋亡[36]。

在腦型瘧疾小鼠模型中，NRG-1刺激ErbB4磷酸化，隨后激活Akt和失活信號轉導與轉錄激活因子-3(signal transducers and activators of transduction- 3, STAT3)，進而通過調節(jié)ErbB4/ Akt /STAT3信號通路降低實驗腦型瘧疾(experimental cerebral malaria, ECM)的死亡率。不僅如此，NRG-1還降低了全身及腦組織中促炎因子TNF-ɑ、IL-6、IL-1ɑ和趨化因子10 (chemokine 10, CXCL10)的表達，增強了抗炎因子IL-5和IL-13的表達，同時降低了腦微血管中白細胞的積累[37-38]。

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)和肺部炎癥時NRG-1的升高與炎癥密切相關，會導致上皮細胞人表皮生長因子受體2( human epidermal growth factor receptor 2, HER2)受體活化，提示ALI患者的NRG-1/HER2通路是活躍的，并且NRG-1/HER2可以通過IL-1β監(jiān)管炎癥小體誘發(fā)的肺泡細胞的滲透性[39-40]。

應用盲腸結扎穿刺的實驗提示建立大鼠膿毒血癥模型，證實NRG-1通過抑制免疫炎癥反應和腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)的過度激活來改善心功能，保護膿毒癥大鼠心肌細胞。NRG-1的治療可減輕膿毒癥引起的認知功能障礙及相關生化指標的變化，進而提高大鼠的存活率。SD大鼠膿毒癥模型中通過尾靜脈注射NRG-1，大大降低TNF-ɑ、IL-1β和IL-6的水平[41-42]。綜上所述，在免疫調節(jié)方面，NRG-1/ErbB系統(tǒng)可以誘導巨噬細胞向抗炎型極化。

在抗炎作用中，NRG-1激活ErbB2和/或ErbB4受體，通過NF-κB通路降低IKK磷酸化水平和降低P65、P50轉移來發(fā)揮抗炎作用。炎癥的有效控制可以為組織再生提供良好的微環(huán)境，但具體的抗炎效果和機制還有待進一步深入研究。

4 NRG-1/ErbB在血管再生中的作用及機制

NRG-1可以促進血管的形成和再生。NRG-1誘導大鼠腹股溝脂肪干細胞，促進血管生成，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)升高[43]。在缺氧/血清剝奪的情況下，人心肌微血管內(nèi)皮細胞自分泌NRG-1，通過VEGF/胎肝激酶1(fetal liver kinase 1, Flk1)通路、促血管生成素-1 (angiopoietin-1, Ang-1)/血管生成素受體酪氨酸激酶2(tyrosine kinase receptors with immunoglobulin and EGF homology domains receptors-2,Tie-2)通路促進血管生成[44]。內(nèi)皮源性NRG-1在缺血肢體損傷的血管生成和動脈生成反應中起重要作用，其機制可能是通過激活整合素和ERK信號介導[45]。用NF-κB阻滯劑阻滯人結腸癌細胞，證實NRG-1通過NF-κB及MARK通路促進人結腸癌細胞VEGF的表達[46-47]。因此，NRG-1在促進多能干細胞血管分化中起重要的作用。

5 NRG-1/ErbB在神經(jīng)再生中的作用及機制

NRG-1是神經(jīng)調節(jié)蛋白家族中最具特征的信號蛋白，其功能涉及神經(jīng)元遷移、增殖和分化[48]。在神經(jīng)損傷時，NRG-1能促進神經(jīng)元遷移、軸突生長、髓鞘和突觸的形成以及促進神經(jīng)再生。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷時有強烈的促進髓鞘再生作用[49]。施萬細胞與神經(jīng)元干細胞共培養(yǎng)可以通過NRG-1/ErbB信號通路誘導神經(jīng)元干細胞分化，起到神經(jīng)修復的作用[50]。研究證實NRG-1介導的PI3K/Akt、MAPK/Erk1/2信號通路參與干細胞的成神經(jīng)向分化和神經(jīng)修復[51]。神經(jīng)嵴缺乏鈣蛋白B1的小鼠在施萬細胞分化和髓鞘形成方面存在缺陷，NRG-1與施萬細胞前體可以共同啟動細胞質鈣離子的增加，激活鈣調蛋白和下游轉錄因子激活T細胞的核因子-胞質3(nuclear factor of activated T- cells, cytoplasmic 3, NFATc3)和c4。鈣調蛋白和NFAT對于神經(jīng)調節(jié)蛋白和ErbB信號轉導、神經(jīng)嵴的多樣化和施萬細胞的分化是必不可少的[52]。

6 NRG-1/ErbB在骨組織再生的作用及機制

關于NRG-1/ErbB對于骨再生的作用鮮有報道。現(xiàn)有研究表明加入外源性的NRG-1，不能促進人間充質干細胞(human mesenchymal stromal cells, hMSCs)的成骨分化，但也不抑制成骨相關基因的表達。內(nèi)源性的增強NRG-1的表達會抑制hMSCs的成骨相關基因的表達，但是抑制ErbB3受體可以促進hMSCs向成骨分化，并且高表達成骨相關因子[53-55]。

7 NRG-1/ErbB在口腔組織再生中的作用

ErbB受體廣泛分布于胚胎的內(nèi)、中、外三個胚層[56]。應用免疫定位技術檢測正常和炎癥牙齦組織中細胞表面EGF受體的表達[57]，結果表明，牙齦組織細胞表面表達EGF受體，在炎癥反應過程中，細胞表面的表皮生長因子受體上調，但是目前尚無EGF受體表達的類型及抗炎機制的相關研究。在神經(jīng)組織再生中，利用起源于神經(jīng)嵴的牙髓干細胞(dental pulp stem cells, DPSCs)，經(jīng)過成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)+血小板源生長因子(platelet growth factor, PDGF)+NRG-1β誘導，可分化成施萬細胞并強表達s100鈣結合蛋白β (s100 calcium binding protein β, S100β)[58]。另有研究表明在條件培養(yǎng)基佛司可林+bFGF +PDGF-AA +NRG-β的培養(yǎng)下，DPSCs分化為分化的牙髓干細胞(differentiated DPSCs, d-PDSCs)[59]，NRG-1可以促進DPSCs向施萬細胞分化，為神經(jīng)組織再生提供種子細胞。NRG-1是否可以作用于口腔其他組織細胞，為口腔組織再生提供有效因子以及作用機制尚有待進一步深入研究。

綜上所述，NRG-1應用于組織工程是一個新的突破，NRG-1可以促進干細胞增殖、遷移、抗凋亡，還可以抗炎，在免疫調節(jié)方面可以促進巨噬細胞向抗炎型極化；在干細胞分化方面可以促進干細胞向血管、神經(jīng)方面分化；對于成骨方面，雖然外源性加入對成骨無促進或抑制作用，可以通過聯(lián)合應用其他促進成骨的因子和材料完善其促成骨功能。在口腔組織工程中我們同樣需要生長因子促進細胞的增殖、遷移及定向分化，針對有炎癥的組織還需要抗炎作用，NRG-1的作用恰好可以為口腔組織工程提供一個有效的生長因子，目前的研究表明NRG-1可以作用于牙髓干細胞并促進定向分化，但是否可以作用于口腔組織的其他細胞還未見報道，我們將對此進行深入研究以期為口腔組織工程提供新思路和新策略。