軟體動物皰疹病毒及其對貝類養殖產業的危害*

白昌明 辛魯生 王崇明

(中國水產科學研究院黃海水產研究所 農業農村部海水養殖病害防治重點實驗室 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室 青島市海水養殖流行病學與生物安保重點實驗室 青島 266071)

貝類增養殖是海水養殖業的重要支柱之一，具有重要的社會、經濟和生態價值。近年來，中國海水貝類養殖的年產量呈穩步上升趨勢；2018 年，中國海水貝類養殖產量達1444 萬t，占海水養殖總產量的71.1%(中國漁業統計年鑒)。隨著貝類養殖產業總體規模的不斷擴大，養殖病害問題日益嚴重。據統計，2019 年中國貝類養殖產業因疫病造成的經濟損失高達88.7 億元(中國水生動物衛生狀況報告)。受流行性疫病的影響，中國部分地區、部分種類的貝類養殖規模大幅萎縮，甚至瀕臨崩潰。如20 世紀90 年代末，中國北方養殖櫛孔扇貝(Chlamys farreri)和南方養殖雜色鮑(Haliotis diversicolor supertexta)，分別因感染牡蠣皰疹病毒(Ostreid herpesvirus 1, OsHV-1)和鮑皰疹病毒(Haliotid herpesvirus 1, HaHV-1)暴發大規模死亡。受此疫情影響，中國養殖櫛孔扇貝年產量從發病前(1996 年)的60 多萬t 驟減到1998 年不足20 萬t (Guo et al, 2016)；雜色鮑在全國鮑產量中的占比由發病前的65%驟降至不足5%(Wu et al, 2016)。與此同時，OsHV-1 和HaHV-1 病害也在其他國家頻繁發生，分別引起雙殼貝類和腹足貝類的大規模死亡，成為近年來威脅全球貝類養殖產業健康發展的主要疫病。本文對OsHV-1 和HaHV-1 2 種皰疹病毒的出現與傳播、病毒特征與變異演化、致病特征與診斷技術，以及此類病毒病的防控等方面取得的重要研究進展進行總結和回顧，并展望未來軟體動物皰疹病毒研究和病害防控工作的重點。

1 軟體動物皰疹病毒的發現與傳播

1.1 牡蠣皰疹病毒的發現及對中國貝類養殖業的危害

首例貝類感染皰疹病毒的案例發現于1972 年，宿主是來自美國馬里蘭州的一批實驗用養殖美洲牡蠣(Crassostrea virginica)，這也是皰疹病毒感染無脊椎動物的首例報道(Farley et al, 1972)。此次感染案例僅限于實驗用貝，未對養殖和野生貝類種群造成影響。Farley 等對引起感染的皰疹樣病毒病原僅進行了電鏡觀察，未開展進一步研究。皰疹病毒對貝類養殖產業的危害真正引起人們廣泛關注是1991 年以來，相關流行病相繼在歐洲、澳洲和南、北美洲多國發生，引起以長牡蠣(Crassostrea gigas)為代表的多種養殖雙殼貝類大規模死亡(Hine et al, 1992; Renault et al,2001b; Barbosa-Solomieu et al, 2015)。Davison 等(2005)對感染法國長牡蠣幼蟲的病毒粒子進行純化、電鏡觀察、全基因組測序和比對分析，發現感染長牡蠣等貝類的皰疹病毒為一種新皰疹病毒。2008 年，國際病毒分類委員會(ICTV)將感染雙殼貝類的皰疹病毒正式命名為牡蠣皰疹病毒 1 (Ostreid herpesvirus 1,OsHV-1)。我國首例因皰疹病毒感染引起的貝類致死案例發生于1997 年，引起我國北方養殖櫛孔扇貝在高溫季節持續發生大規模死亡。根據此次疫病流行和致病特點，中國科研人員將其命名為扇貝急性病毒性壞死病(AVND)(宋微波等, 2001)，對應的病原稱為扇貝急性病毒性壞死病毒(AVNV) (王崇明等, 2002)。對AVNV 基因組序列測定和分析結果顯示，AVNV 與OsHV-1 基因組相似度達97%，為同一種病毒的不同變異株(Ren et al, 2013)。

與歐美等國頻繁發生OsHV-1 感染引起的長牡蠣死亡不同，中國受OsHV-1 感染影響的貝類種類更加多元化(Bai et al, 2015)，其中，受影響較大的貝類及其首次發現年份分別為：櫛孔扇貝(1997 年)、長牡蠣(2009 年)、魁蚶(Scapharca broughtonii) (2012 年)和毛蚶(Scapharca subcrenata) (2019 年)。據統計，1997 年暴發的AVND 導致山東省2 萬hm2養殖櫛孔扇貝60%絕產，直接經濟損失約15 億元，1998 年的疫情更加嚴重(張福綏等, 1999)。中國長牡蠣感染OsHV-1 的案例最早報道于2009 年，僅造成人工繁育幼蟲的死亡(未發表數據)。韓國(2009 年)、日本(2010 年)也相繼報道了長牡蠣感染OsHV-1 的案例，尚未出現對其國內長牡蠣養殖產業構成嚴重威脅的大規模疫情(Hwang et al, 2013; Nagai et al, 2018)。近年來，中國牡蠣人工育苗比例越來越大，2019～2020 年對遼寧和福建等地育苗場開展的流行病學調查結果顯示，OsHV-1 感染引起的牡蠣幼蟲死亡事件頻繁發生，發病幼蟲樣本病毒載量達106～107病毒拷貝/ng 總DNA(未發表數據)。

2012～2018 年，中國北方育苗場及出口加工企業室內暫養的魁蚶成貝頻繁發生大規模死亡，經流行病學調查和病原鑒定，確定一種OsHV-1 新變異株是引發魁蚶大規模死亡的病原(Bai et al, 2016; Xia et al,2015)。魁蚶種貝死亡主要發生在升溫(每天1℃)促熟過程中，當水溫升高至18℃左右時出現死亡；出口加工企業魁蚶成貝死亡發生在夏初暫養池水溫達到13℃左右時。病死魁蚶普遍出現雙殼閉合不全、爛鰓、出血和內臟團蒼白等非典型臨床癥狀，死亡率往往達到100%(Bai et al, 2016)。2017 年，從廣東省深圳市東山碼頭獲取的毛蚶樣本中檢測到高載量的OsHV-1 DNA，但對產地毛蚶種群是否有影響尚不清楚(Gao et al, 2018b)。2019 年，山東萊州育苗企業從山東、浙江等地引進的毛蚶種貝，在產卵前或產卵期間發生OsHV-1 感染導致的大規模死亡，發病時育苗池水溫約21℃(未發表數據)。以上結果提示，我國養殖的牡蠣等貝類中存在多種對OsHV-1 易感的種類，貝類育苗和養殖企業應該注重防范生產過程中的貝類皰疹病毒病害。

1.2 牡蠣皰疹病毒的全球傳播和分布范圍

與脊椎動物皰疹病毒較強的宿主專一性不同，OsHV-1的宿主范圍較廣，目前已知能感染13種雙殼貝類(圖1)，其中包括牡蠣6種：長牡蠣、歐洲牡蠣(Ostrea edulis)(Comps et al, 1993)、新西蘭牡蠣(Ostrea angasi)(Hine et al, 1997)、智利牡蠣(Ostrea chilensis)(Hine et al, 1998)、福建牡蠣(Crassostrea angulata)和矮牡蠣(Ostrea stentina)(López-Sanmartín et al,2016a)；扇貝3種：櫛孔扇貝(宋微波等, 2001; 王崇明等, 2002)、歐洲大扇貝(Pecten maximus)(Arzul et al,2001a)和海灣扇貝(Argopecten irradians)(Kim et al,2019)；蛤仔2 種：菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)(Renault et al, 2001c)和歐洲蛤仔(Ruditapes decussatus)(Arzul et al, 2001b)；蚶類2 種：魁蚶(Bai et al, 2016)和毛蚶(Gao et al, 2018b)。

圖1 OsHV-1 在全球主要國家和地區首次發現的時間及感染物種Fig.1 The first occurence of OsHV-1 in major countries and associated mollusks

截止目前，已在全球17 個國家檢測到OsHV-1感染病例，遍布于非洲和南極洲之外的各大洲。長牡蠣作為養殖范圍最廣、產量最大的貝類，也是受OsHV-1 危害最嚴重的種類，其感染案例在17 個國家均有分布，而其他貝類品種的感染案例通常只局限于一個國家。

1.3 鮑皰疹病毒發現、傳播及對中國鮑養殖業的危害

皰疹樣病毒粒子感染腹足貝類的案例首次發現于1999年，引起中國福建東山地區雜色鮑大規模死亡，隨后幾年在中國南方雜色鮑養殖區廣泛傳播(Wang et al, 2004)。病鮑主要表現為攝食量減少、活力下降和黏液分泌增多等非典型癥狀，出現癥狀3～7 d后即發生大規模死亡(宋振榮等, 2000)。這也是鮑首次因病毒感染發生急性死亡的案例，從出現癥狀到大規模死亡僅3～5 d，致死率高達95%以上(Wang et al,2004)。流行病學調查結果顯示，該疫病只發生在南方水溫較低的季節，因此被稱為鮑低溫病毒病。但當時因技術所限，未能進一步鑒定該病毒病原，該疫病在我國也被稱為鮑病毒性死亡病。2003和2005年，臺灣地區養殖雜色鮑和澳大利亞的黑唇鮑(Haliotis rubra)、綠唇鮑(Haliotis laevigata)及其雜交種，分別發生類似的皰疹病毒引起的急性病毒性大規模死亡(Chang et al, 2005; Hooper et al, 2007)。病鮑表現的主要病理特征是腹足神經節和中樞神經組織炎癥和細胞浸潤，因此，該病又被稱為鮑病毒性神經炎(Abalone viral ganglioneuritis, AVG)(Hooper et al, 2007)。對感染澳大利亞鮑的皰疹病毒粒子進行基因組序列測定和分析，結果顯示，AVG病原為一種新皰疹病毒，與OsHV-1的親緣關系較近，ICTV將該病毒命名為鮑皰疹病毒1 (Haliotid herpesvirus 1, HaHV-1)。

根據最近開展的回溯性研究，中國南方1999年起發生的鮑低溫病毒病病原，與臺灣地區和澳大利亞發生的AVG病原為同一種病毒，即鮑皰疹病毒(Bai et al,2019a; Wei et al, 2018)。由于HaHV-1的高傳染性和致死率，其在中國南方反復發作幾年后，目前中國雜色鮑養殖產業幾近滅絕。截止目前，只在以上3個國家和地區發現HaHV-1感染案例，其易感物種除了以上提到的幾種外，還有棕唇鮑(Haliotis conicopora)。研究結果還證實，新西蘭黑金鮑(Haliotis iris)與皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)對HaHV-1不敏感(Bai et al,2019a; Corbeil et al, 2017)。

2 軟體動物皰疹病毒的基本特征與株系分化

2.1 軟體動物皰疹病毒的分類地位

軟體動物皰疹病毒與已知感染陸生和水生脊椎動物的皰疹病毒親緣關系較遠。2011 年，ICTV 在其發布的第九次報告中，將原皰疹病毒科提升為皰疹病毒目(Herpesvirales)，重新設置3 個皰疹病毒科，其成員分別感染陸生脊椎動物、水生脊椎動物和無脊椎動物(Davison et al, 2002)(圖2)。其中，軟體動物皰疹病毒科(Malacoherpesviridae)目前由2 個屬(Ostreavirus和Aurivirus)組成，每個屬包含1 個病毒種，分別為OsHV-1 和HaHV-1 (Minson et al, 2011)。

圖2 皰疹病毒目系統發育樹拓撲結構示意圖(獲ELSEVIER 出版集團授權刊載)Fig.2 A sketch of the herpesvirus evolutionary tree (Reprinted with permission from Elsevier)

2.2 軟體動物皰疹病毒的結構與基因組特征

軟體動物皰疹病毒核衣殼具有皰疹病毒典型的正二十面體結構，核衣殼內是以雙鏈DNA 為核心的遺傳物質(圖3)。核衣殼在細胞核內完成裝配，并被運出細胞核，在高爾基體及釋放到胞外過程中完成被膜(Tegument)和囊膜的裝配。有關OsHV-1 形態結構的電鏡觀測報道相對較多，涉及多個物種，其核衣殼直徑在71～111 nm 之間，裝配好的病毒顆粒直徑為106～153 nm (圖3A) (Arzul et al, 2001a; Bai et al, 2016;Hine et al, 1998; Renault et al, 2000a)。HaHV-1 相關的研究報道較少，其核衣殼直徑約為100 nm (圖3B)，僅有1 例報道觀察到處于細胞外、完成裝配的病毒粒子，直徑約為165 nm (Corbeil et al, 2012)。僅憑電鏡下病毒的形態特征不能區分OsHV-1 和HaHV-1。

OsHV-1 和HaHV-1 基因組大小相似，約為210 kb，但其GC 含量不同，分別為38.7%和46.8% (Davison et al, 2005; Savin et al, 2010)。皰疹病毒的基因組并不是簡單的單一序列，而是由多個直接或反向重復序列與數個單一序列按不同模式間隔排列組成。根據排列模式的不同，可以把皰疹病毒基因組分為6 種類型(Roizman et al, 2001)。OsHV-1 的結構模式可以概括為TRL-UL-IRL-X-IRS-US-TRS，其中UL和US是單一序列，在參考基因組中的長度分別為167843 和3370 bp，TRL/IRL和TRS/IRS是2 對反向重復序列，長度分別為9774 和7584 bp，X 也是單一序列，長度為1510 bp(Davison et al, 2005)。利用高通量測序技術對OsHV-1 微變株(OsHV-1μvar)的深度測序結果表明，X 區的測序深度是OsHV-1 基因組其他區域的2 倍，推測OsHV-1 微變株基因組包含雙拷貝的X 區，另一個位于基因組末端。因此，微變株的基因組結構可能是 TRL-UL-IRL-X-IRS-US-TRS-X’或 X’-TRL-UL-IRLX-IRS-US-TRS(Abbadi et al, 2018; Burioli et al, 2017)。不同變異株基因組結構單元的長度可能有差異，但其結構模式相似(Ren et al, 2013; Xia et al, 2015)。預測OsHV-1 基因組編碼124 個開放閱讀框(Open reading frame, ORF)(Davison et al, 2005)。HaHV-1 的結構模式相對簡單，可以概括為TRL-UL-IRL-IRS-US-TRS，預測編碼110 個ORFs (數據未發表)。

圖3 OsHV-1 感染魁蚶(A)和HaHV-1 感染雜色鮑(B)細胞核中觀察到的皰疹樣病毒Fig.3 Viral particles identified in the nuclei of OsHV-1 infected S. broughtonii (A) and HaHV-1 infected H. diversicolor supertexta (B)

2.3 軟體動物皰疹病毒的變異與株系分化

軟體動物皰疹病毒在自然界存在多種變異株，它們的組成和比例不斷演化，以適應不斷變化的生態環境。目前，研究較多的OsHV-1 變異株有參考株(Davison et al, 2005)、扇貝急性病毒性壞死病毒(AVNV)、微變株(OsHV-1μvar)和魁蚶株(OsHV-1-SB)；其中，參考株和微變株最早都發現于長牡蠣養殖業發達的法國(Davison et al, 2005; Segarra et al, 2010)，AVNV 和OsHV-1-SB 分別來自中國養殖櫛孔扇貝和魁蚶(Bai et al, 2016; Ren et al, 2013)。已公布的OsHV-1 7 個變異株基因組序列相似性為93.5% (Bai et al, 2019b)，而單純皰疹病毒2 (Herpes simplex virus 2)與單純皰疹病毒1 (Herpes simplex virus 1)的這一比例分別為99.6%和96.8% (Norberg et al, 2007; Szpara et al, 2014)。OsHV-1 不同變異株間相對較低的序列相似度，可能與其和不同宿主長期協同進化過程中發生較強的株系分化有關。

基于不同OsHV-1 變異株基因組序列構建的系統發育樹顯示，各變異株以其宿主不同(櫛孔扇貝、長牡蠣和魁蚶)分為3 個支系，說明宿主范圍在該病毒系統分化過程中占主導地位(Bai et al, 2019b)。在宿主為長牡蠣的病毒支系中，在法國海區先后發現的OsHV-1 參考株和微變株之間呈姊妹支關系，而不是祖先與后代關系(Segarra et al, 2010; Bai et al, 2019b)。根據病毒基因組高變異位點序列，多個研究團隊分析了本國或部分區域內OsHV-1 不同變異株的演化和變異規律(Bai et al, 2015; Batista et al, 2015; Mineur et al,2015; Renault et al, 2012; Shimahara et al, 2012)。對中國2001～2013 年間27 個海區貝類樣品OsHV-1 的感染情況、C2/C6 位點序列變異、病毒株系分化及其時空分布規律進行分析，發現中國存在多達24 種變異株，OsHV-1 種群間存在因地理隔離和時間推移產生的種群分化(Bai et al, 2015)。基于不同地區變異株C2/C6 位點多態性差異等分析結果，Mineur 等(2015)推測，OsHV-1 起源于亞洲地區，伴隨長牡蠣引種傳播到全球各地，但目前這一假說尚未得到更多數據的支撐。目前，OsHV-1 的起源和全球傳播過程還不清楚，現有結果表明，OsHV-1 是一個古老的皰疹病毒支系，已與其天然宿主經過長期的協同演化過程。自然界存在多個OsHV-1 變異株，近年來在貝類高密度養殖、脫離原有生境等的應激壓力下，OsHV-1 病害相繼發生。

法國開展的OsHV-1 分子流行病學監測結果顯示，OsHV-1 新變異株的不斷出現給貝類養殖產業造成嚴重威脅。例如，OsHV-1 最初在法國暴發時致病力較弱，雖然造成的長牡蠣幼蟲死亡曾引起苗種短缺，給當地養殖業造成不利影響，但法國長牡蠣年產量僅小幅下挫，從1991 年的12.9 萬t 跌至2007 的11.1 萬t (FAO 漁業統計年鑒)。2008 年，法國開始大范圍流行致病力更強的微變株(OsHV-1μvar)，主要引起海區養殖稚貝和幼貝的大規模死亡，導致近年來法國長牡蠣年產量跌至6.4 萬t (FAO 漁業統計年鑒)。這些結果提示，未來應加強OsHV-1 的分子流行病學監測，及時評估和應對新變異株對中國貝類養殖業造成的威脅。

HaHV-1 株系分化和分子流行病學的相關研究還很欠缺，根據其地理分布分為中國大陸株、臺灣株和澳大利亞株，它們基因組序列間的相似度為91.5%(Bai et al, 2019c; Chen et al, 2016; Savin et al, 2010)。已知的HaHV-1 易感宿主都來自Haliotis 屬，均引起宿主的急性感染和死亡。然而，2009 年起，臺灣地區發生皰疹病毒引起的雜色鮑慢性死亡案例，死亡可從早春一直持續到秋季，累計死亡率達80%左右，成為臺灣鮑養殖業面臨的主要疫病(Chen et al, 2016)。基于HaHV-1 基因組設計的20 對引物，均不能從慢性死亡鮑樣本中擴增出條帶，推測引起鮑慢性死亡的皰疹病毒與HaHV-1 基因組序列相似度很低，其與HaHV-1 的關系還有待進一步研究(Chen et al, 2016)。

3 軟體動物皰疹病毒感染的致病特征

3.1 病理特征

OsHV-1 感染的病理變化廣泛分布于各主要器官的結締組織，如外套膜、鰓、肝胰腺和生殖腺等，病變組織內常伴有以染色質邊集和核固縮為特征的異常細胞核(Renault et al, 2000a; Segarra et al, 2016)。常見的受感染細胞類型有成纖維細胞、血淋巴細胞，偶爾也能觀察到感染的神經細胞和肌細胞(Lipart et al,2002; Segarra et al, 2016; Xin et al, 2018)。利用原位雜交技術在發病牡蠣生殖腺中還觀察到被病毒DNA 探針標記的感染細胞，部分細胞鑒定為卵母細胞(Corbeil et al, 2015)，從分離的卵細胞和精細胞中檢測到病毒DNA，推測OsHV-1 存在垂直傳播的可能性(López-Sanmartín et al, 2016b)。另外，在部分歐洲牡蠣(Comps et al, 1993)和新西蘭牡蠣(Hine et al, 1997)感染案例中，觀察到核內Cowdry type A 型包涵體，但未在包括長牡蠣在內的其他貝類中發現包涵體(Arzul et al, 2017)。

HaHV-1 澳大利亞株和臺灣株感染的組織病變集中在中樞神經組織，而引起鮑慢性死亡的皰疹病毒主要感染血淋巴細胞，并造成結締組織損傷和血細胞浸潤(Chen et al, 2016)。Bai 等(2020)基于組織病理和原位雜交的分析結果顯示，HaHV-1 大陸株感染不僅引起雜色鮑足神經節和中樞神經組織病變，在外周神經組織、感染后期的外套膜、肝胰腺等器官的結締組織也出現病變和病毒探針標記的感染細胞；利用透射電鏡，還在感染的鮑血淋巴細胞中觀察到皰疹樣病毒粒子。目前，HaHV-1 中國大陸與臺灣株、澳大利亞株組織親嗜性差異的原因還不清楚，我們推測與宿主和病原如下兩方面的差異相關，一是由HaHV-1 不同地理種群株系分化導致的致病性差異，二是宿主品種或品系差異引起組織器官易感性不同。

3.2 疫病發生和流行規律

溫度是影響OsHV-1 與HaHV-1 感染強度，發病與否和危害程度的關鍵環境因子(Arzul et al, 2017)，但2 種病毒對溫度的響應模式相反：OsHV-1 感染在水溫上升到某個閾值的高溫季節發病，HaHV-1 感染在水溫下降到某個閾值的低溫季節發病。OsHV-1 感染發病的溫度閾值大小受變異株和宿主物種的共同影響，如OsHV-1 參考株(2008 年之前)感染長牡蠣在21.5℃～26.8℃之間時發病(Sauvage et al, 2009)，OsHV-1μvar (2008 年之后)感染長牡蠣在 15.5℃～23.8℃之間時發病(Pernet et al, 2012; Petton et al,2015)，櫛孔扇貝在23℃以上時發病(宋微波等, 2001;王崇明等, 2002)，魁蚶在14℃以上時發病(Xin et al,2020)。不同的海區環境(如維度、理化因子等)也會影響溫度閾值。近年來，法國及歐洲養殖長牡蠣發病的溫度閾值一般為16℃，而澳大利亞養殖長牡蠣發病的溫度閾值一般是21℃ (de Kantzow et al, 2019)。除溫度之外，其他環境因子也對OsHV-1 疫病產生影響，如鹽度(Fuhrmann et al, 2018、2016)、環境微生物(Azema et al, 2016; Pathirana et al, 2019)、餌料豐度(Pernet et al, 2019b)和pH 值(Fuhrmann et al, 2019)等。但這類環境因子對OsHV-1 疫病的影響效應不如溫度直接和明確。溫度主要通過控制病毒是否進入指數復制期發揮作用，其效應更加明顯和可預測；其他環境因子主要通過與宿主間復雜的相互作用發揮作用，其對疫病發生和進程的影響表現出明顯的地區特異性(Fleury et al, 2020; Pernet et al, 2019b)。

Oden 等(2011)對病毒感染長牡蠣的研究結果顯示，OsHV-1 感染是否引發宿主的發病和死亡主要取決于病毒在宿主體內的拷貝數，如果病毒拷貝數超過8.8×103個/mg 組織，則會發病和死亡，否則通常以無癥狀感染的形式長期存在。除櫛孔扇貝、魁蚶、毛蚶和新西蘭牡蠣之外，OsHV-1 感染引發的病亡主要發生于幼蟲和稚貝階段。對長牡蠣、福建牡蠣等的流行病學監測結果顯示，其成貝往往不表現任何臨床癥狀，體內病毒感染量也多在103個/mg 組織以下，這些無癥狀的成貝就成為OsHV-1 在自然界中的天然“蓄水池”，且存在將病毒經垂直傳播給下一代的可能(Barbosa-Solomieu et al, 2005; López-Sanmartín et al,2016b)。目前，尚無證據顯示HaHV-1 感染也表現類似的對宿主發育階段的偏好性。

Paul-Pont 等(2013b)對澳大利亞Botany 灣OsHV-1致死病例的空間分布規律研究顯示，牡蠣發病呈聚集性“斑塊”狀分布，斑塊大小在幾個閥架至數公里不等，斑塊的空間分布主要與牡蠣月齡和灣內洋流方向相關。Paul-Pont 等推測，OsHV-1 的水平傳播方式主要是粘附于水中的浮游生物，依賴洋流傳播。

4 軟體動物皰疹病毒診斷方法

4.1 傳統診斷技術

組織病理和透射電鏡檢測作為傳統的貝類疫病診斷技術，已被應用到軟體動物皰疹病毒的診斷工作中。OsHV-1 感染的診斷可以取外套膜、肝胰腺和鰓等組織器官，HaHV-1 感染診斷須首先小心對鮑腹足進行縱切，而后取足神經節進行檢測(Mark et al,2016)。歐盟貝類病害參考實驗室提供了詳細的樣本處理、檢測操作規程。在光鏡下觀察，若雙殼貝類樣本結締組織出現大量細胞浸潤，其中的成纖維細胞和血細胞呈現染色質邊集或核濃縮等細胞病變，則為疑似OsHV-1 感染。若鮑樣本足神經節和中樞神經組織出現病變，則為疑似HaHV-1 感染。組織病理變化不是特異性的，因此不能用于確診。透射電鏡下，細胞核內觀察到皰疹樣病毒粒子，可判定檢測結果為陽性；但這種檢測不是種特異性的，需要結合分子生物學技術，做出最后確診。

4.2 現代診斷技術

4.2.1 基于PCR 法的診斷技術 聚合酶鏈反應(PCR)診斷技術以其高敏感性、高特異性和快速簡便的優點，已成為包括貝類在內眾多水產動物病原常用的檢測技術。法國學者首先設計了OsHV-1 巢式PCR檢測用引物(A3/A4 和A5/A6)(Renault et al, 2000b)，但很快被檢測靈敏度更高的普通 PCR 檢測引物(C2/C6)所取代(Renault et al, 2001a)。隨后，多種OsHV-1 檢測用PCR 引物相繼報道，但多數引物的檢測靈敏度和特異性未得到充分驗證，C2/C6 仍是目前應用最廣泛的普通PCR 引物(Batista et al, 2007)。實時定量PCR 檢測憑借其可對感染量進行精確測定的優勢，近年來越來越多的被應用到涉及OsHV-1 檢測的各種研究項目中。目前，常用的OsHV-1 實時定量PCR 檢測方法有2 種，分別是使用C9/C10 的SYBR Green 法和使用 OsHV1BF/B4 引物及對應探針的TaqMan 探針法(Martenot et al, 2010; Pepin et al,2008)。對HaHV-1 檢測方法的研究相對較少，但也有比較成熟的普通PCR 和實時定量PCR 檢測方法可供使用(Mark et al, 2016)。

4.2.2 原位雜交診斷技術 原位雜交技術具有細胞定位能力準確、特異性好和敏感度高等優點。OsHV-1和HaHV-1原位雜交檢測均使用地高辛標記探針。OsHV-1檢測有3種大小相似的探針可供選擇，分別由3 對引物(A5/A6、C1/C6 和C2/C6)擴增產生(Corbeil et al, 2015; Lipart et al, 2002)；HaHV-1檢測一般使用ORF66F/R引物合成探針(Mark et al, 2016)。另外，Corbeil等(2015)開發了一種可以檢測OsHV-1 3個病毒RNA(ORF7、25和87)原位表達情況的探針雜交技術。

4.2.3 其他分子診斷技術 除了上述實驗室常用的診斷技術外，中國研究人員還基于環介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)和熒光定量重組酶聚合酶擴增(Quantitative recombinase polymerase amplification, qRPA)技術，開發了OsHV-1和HaHV-1 的檢測方法(Chen et al, 2014; Gao et al,2018a、b; Ren et al, 2010)，這些檢測技術具有更加簡便、快捷、適合現場應用的優點。

5 軟體動物皰疹病毒病的防控

貝類養殖多在開放式海區進行，很多涉及藥物的預防和治療措施無法施展，給包括軟體動物皰疹病毒病在內多種貝類疫病的防控帶來困難。為此，針對軟體動物皰疹病毒，特別是OsHV-1 的生物學特性、發病規律、抗病品系選育等方面開展了大量研究，研發相關防控措施(Barbosa-Solomieu et al, 2015)。但HaHV-1 的相關研究還較少，對該疫病的防控主要依靠劃定病毒污染區、限制鮑及相關物品的跨區流動等基本生物安保措施(Mark et al, 2016)。本節主要介紹OsHV-1 相關防控措施的研究進展。

5.1 OsHV-1 生物學特征及室內消殺措施

貝類的室內養殖一般發生在育苗階段，OsHV-1流行早期(2008 年之前)的多數案例是育苗場幼蟲的死亡。對OsHV-1 生物學特征的研究結果顯示，在室內20℃情況下，OsHV-1 可在海水和死亡牡蠣內臟團中分別存活2 d 和7 d，并仍保持感染能力，給病毒的徹底消殺工作造成一定困難(Hick et al, 2016)。有利的一點是，OsHV-1 作為一種具有脂質囊膜的病毒，在水產養殖環境中屬于比較容易殺滅的病原體。高溫(50℃，5 min)、化學消毒劑(如10%福爾馬林，30 min)、臭氧和紫外線對該病毒均有較好的殺滅作用(Evans et al, 2016; Hick et al, 2016)。由于成貝往往處于隱性感染狀態，有可能作為傳染源被引入育苗場。為了預防此類事件的發生，研究人員建議對進場前的成貝進行熱應激(水溫升至21℃) 2～3 周，以便使成貝體內潛伏感染的OsHV-1 激活和復制，而后進行PCR 檢測，排除潛伏感染成貝帶來的威脅(Hine et al, 1997;Pernet et al, 2015)。

我國部分鮮活貝類上市或出口前需在室內暫養數周，此時養殖密度高，容易暴發流行病和大規模死亡。根據軟體動物皰疹病毒感染的發生受溫度調控這一特點，可通過控制水溫預防疫病的發生。實驗結果和生產實踐均表明，水溫控制在10℃及以下可有效防止魁蚶暫養階段發生OsHV-1 感染。但值得注意的是，不同物種感染軟體動物皰疹病毒后發病的溫度閾值可能不同，需要通過系統的實驗確定。

5.2 開放海區OsHV-1 病害的綜合防控

5.2.1 養殖措施的改善 在法國地中海沿岸，相對開放海區OsHV-1 疫病死亡率低于灣內，插樁式養殖低于吊籃式養殖(Pernet et al, 2012)。澳大利亞和法國開展的研究均表明，增加潮間帶養殖閥架的高度(30～60 cm)可有效降低成貝的OsHV-1 感染率、感染強度和死亡率(Paul-Pont et al, 2013a)。引起這一現象的機制尚不清楚，推測可能是增加養殖閥架高度后，減少了牡蠣浸水和接觸病毒的時間(Paul-Pont et al,2013a; Petton et al, 2015)。但這項措施也會減少牡蠣攝食時間，從而導致生長緩慢、甚至應激反應(Pernet et al, 2019a)。因此，在水文環境復雜、養殖方式多樣的開放式海區，養殖措施的改良應充分考慮苗種來源(人工苗或野生苗)、遺傳背景、繁殖周期和月齡等因素(Evans et al, 2019; Ugalde et al, 2018)；很難形成一套適合所有海區的OsHV-1 防控技術規程，也很難依靠單一技術實現OsHV-1 病害的有效防控(Fleury et al,2020)。遵循“因地制宜、多管齊下”的策略，才能通過養殖措施的優化緩解OsHV-1 給貝類養殖產業帶來的危害。例如，西班牙埃布羅河三角洲地區受OsHV-1疫情的影響，長牡蠣年產量從2006 年的800 t 縮減到2011 年的138 t (Carrasco et al, 2017)。當地通過改良生產周期、避開危險期投放稚貝苗種，控制投苗規格，降低養殖密度和優化生產管理方法等一系列措施，使當地牡蠣養成期死亡率從2015 年之前的約80%，下降到2015 年及之后的2%～7.5% (Carrasco et al, 2017)。

5.2.2 抗病品系選育 對長牡蠣和魁蚶的研究表明，天然存在對OsHV-1 不敏感的家系，這為抗病品系選育提供了自然資源(Bai et al, 2017; Dégremont et al, 2005)。我們開展的感染實驗和生產數據顯示，韓國來源的魁蚶對OsHV-1 普遍不敏感，近年來多被中國魁蚶育苗企業選為種貝。對15 個長牡蠣家系的感染實驗結果顯示，人工感染14 d 后的成活率各不相同，范圍在0～97.4%之間(de Lorgeril et al, 2018)。進一步分析發現，長牡蠣表現出較高的抗OsHV-1 加性遺傳變異，遺傳力大小在0.12～0.63 之間(Azema et al, 2015; Camara et al, 2017; Dégremont et al,2015)。目前，法國、英國和新西蘭等均已啟動各自的抗OsHV-1 長牡蠣選育項目，法國通過對不同長牡蠣家系連續4 代的大規模抗病毒選育，使3～6 月齡牡蠣的成活率提高7%～63% (Dégremont et al, 2015)。

6 結論與展望

中國的貝類養殖規模大、種類全，目前在養的貝類約80 種，發揮著重要的食物供給和生態服務功能(唐啟升等, 2016)。進入21 世紀，貝類的高密度養殖模式和人工苗種繁育技術得以廣泛推廣(唐啟升等,2013; 闕華勇等, 2016)，在推動養殖產量不斷提升的同時，也導致傳染性病害頻繁發生，使中國貝類養殖業蒙受巨大經濟損失。已開展的軟體動物皰疹病毒相關研究使我們對貝類病毒病有了更深入的認識，但仍存在很多知識盲區，如病毒結構蛋白的組成和功能、入侵和致病機制等對病毒病防控至關重要的基礎科學問題(張奇亞等, 2014)；變異株鑒別診斷及其在中國海區的分布范圍和流行規律等，與疫病有效防控息息相關的基本信息也尚未掌握。

當前，中國貝類養殖業尚缺乏生物安保(Biosecurity)理念指導下的疫病風險管理和應對策略(黃倢等,2016)。在此背景下的苗種跨區轉運、南北接力養殖等，都有可能導致病原微生物的傳播，威脅貝類養殖業的健康發展。在貝類主產區建立貝類疫病預警系統(宋林生, 2020)，引入生物安保概念，提高生物安保意識，貫徹和落實生物安保指導下的健康養殖理念(黃倢等, 2016)，才能實現軟體動物皰疹病毒等貝類疫病的有效防控。