背角無齒蚌幼蚌心率對鎘暴露脅迫的響應及預警評估*

陳修報 王安琪 鄭浩然 劉洪波 楊 健,①

(1. 中國水產科學研究院淡水漁業研究中心 中國水產科學研究院長江中下游漁業生態環境評價和資源養護重點實驗室 無錫 214081；2. 南京農業大學無錫漁業學院 無錫 214081)

重金屬鎘(Cd)具有來源廣、積累性強、難以降解、易于沿食物鏈發生生物放大作用等特點，被列為對水生生物和人類危害最大的優先控制污染物之一(Campbell, 2006; 劉天紅等, 2015)。需要高度關注的是，我國漁業生態環境Cd 污染形勢仍較為嚴峻(張聰等, 2018)，其中，江河等天然重要漁業水域中的Cd超標率為1.5%，國家級內陸水產種質資源保護區的Cd 超標率達2.7% (農業部等, 2015)，而水產品中的Cd 殘留現象大量存在，如長三角地區池塘養殖水產品中Cd 的超標率甚至高達100% (和慶等, 2017)。因此，亟需對漁業水環境Cd 污染動態進行早期預警和有效監測。

貝類因具有運動能力差、對污染物的高積累性和低代謝性等特點，被證實為評價水環境污染的理想指示生物(崔正國等, 2015; Farrington et al, 2016)。背角無齒蚌(Anodonta woodiana)作為“淡水貝類觀察”研究體系的專用指示生物(Yang et al, 2008)，已成功預警和監測Cd 等污染狀況(Liu et al, 2010; Chen et al,2019)。利用貝類對水環境Cd 污染的預警監測，可分為“致死性”(如分離出整個軟組織，并測定其中Cd含量)和“非致死性”(如分析心率等生理指示的響應特征) 2 類方法(Liu et al, 2016; 孫珊等, 2017)，而后者越來越受到重視(Liu et al, 2016; Bakhmet et al,2019)。值得注意的是，前人基于貝類心率對Cd 污染監測多集中于應用成體(貝殼不透明)，需要在貝殼上靠近心臟部位鉆一個洞(開一個“窗口”)才能觀察到心臟跳動(Candido et al, 2006; Liu et al, 2016)，這會對貝類產生應激影響并導致污染物從“窗口”滲透進入軟組織，進而影響到貝類真實的心跳規律。本研究發現，背角無齒蚌早期幼蚌對Cd 的脅迫非常敏感(陳修報等, 2017)，且貝殼為透明或半透明狀態，能夠在非致死或非損傷條件下清晰觀察到心率(Chen et al, 2015)。

本研究嘗試利用自主開發的相關研究專用“標準化”背角無齒蚌(陳修報等, 2017)的早期幼蚌(即從心跳清晰可見直至貝殼不再透明發育期的個體)為模式生物，研究其正常的心率規律，并探索其對水環境Cd 毒性的應答特征，以期為從新角度開發基于淡水貝類的早期生物預警和監測技術提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 早期幼蚌采集與心率檢測

在“標準化”背角無齒蚌的人工繁育過程中(Chen et al, 2015)，連續采集從心跳清晰可見直至貝殼不再透明的典型生長階段的早期幼蚌(圖1)：EJ1 [25 日齡，殼長為(1.5±0.1) mm，平均值±標準差，下同，n=30]、EJ2 [55 日齡，殼長為(10.5±0.6) mm，n=30]、EJ3[70 日齡，殼長為(20.4±0.9) mm，n=30]和EJ4 [85 日齡，殼長為(30.0±2.0) mm，n=30]。人工繁育方法及水體理化指標參見Chen 等(2015)。

圖1 “標準化”背角無齒蚌的早期幼蚌(□示心臟)Fig.1 The early juvenile of “standardized” A. woodiana(the square shows the heart)

鑒于背角無齒蚌的活動強度存在一定的晝夜節律變化(早晨最低，傍晚最大)(吳慶龍等, 2005)，為了確認早期幼蚌的心率是否具有日間分時變化差異，分別在09:00～10:00 和16:00～17:00 采集同一批次的早期幼蚌(n=30)，依據Pandolfo 等(2009)對淡水貝類幼蚌心率的觀察方法，用解剖鏡直接觀察不同生長階段早期幼蚌的心率。根據Liu 等(2016)的統計方法，心率定義為1 min 觀察到的心跳次數。

1.2 Cd 暴露實驗

根據淡水貝類毒理學實驗規范(ASTM, 2006;陳修報等, 2017)，參考我國《漁業水質標準》(GB11607-89)規定的Cd 限量(0.005 mg/L)和作者前期研究獲得的 Cd2+對背角無齒蚌幼蚌的安全濃度(0.45 mg/L)(陳修報等, 2017)，用人工配制軟水(ASTM,2006)和CdCl2(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)配制5 個Cd2+理論濃度梯度：0 (對照組)、0.0025、0.005、0.025、0.1 和0.5 mg/L；實測Cd2+濃度分別為0、0.0026、0.005、0.026、0.11 和0.55 mg/L。Cd2+實測濃度和理論濃度的偏差均＜10%，本研究采用理論濃度對結果進行分析和討論。對照組和暴露組各設置3 個平行。

綜合考慮不同生長階段早期幼蚌在自然水環境中的存活率及監測適宜規格，本研究選取EJ4 階段的早期幼蚌作為暴露對象。用500 ml 玻璃培養皿作實驗容器，溶液200 ml，每個培養皿加入5 個幼蚌，每24 h 全部更換溶液以保持Cd2+濃度穩定，實驗期間不投餌。實驗于貝類重金屬暴露系統(上海海圣水族設備廠)中進行，水溫保持在(20±1)℃，16 h 光照︰8 h 黑暗，光照強度為1000 lx。實驗持續96 h，并于24、48、72 和96 h 取樣，觀察心率。心率的觀察和統計方法同1.1。

1.3 統計分析

所得數據運用SPSS 22.0 統計軟件分析。應用Paired t-test 比較不同生長階段早期幼蚌的心率差異性，以及Cd 暴露期間的早期幼蚌心率差異水平。應用Pearson 等級相關系數分析心率與殼長、日齡及Cd暴露濃度、暴露時間之間的相關性，并用回歸分析變量之間的關系。P＜0.05 表示差異水平或相關性顯著。

2 結果

2.1 早期幼蚌的心率

不同生長階段的“標準化”背角無齒蚌早期幼蚌的心率見表1。EJ1、EJ3 和EJ4 的心率在09:00～10:00和16:00～17:00 之間保持一致(P＞0.05)，只有EJ2 在前期的心率略高于下午(P＜0.05)。隨著日齡的增加或殼長的增長，早期幼蚌的心率逐漸降低(表1)，心率(H)與日齡(D)和殼長(L)之間均呈顯著線性負相關(P＜0.05; 圖2)。

2.2 Cd 對早期幼蚌心率的影響

如圖3所示，暴露期間，對照組(0)、0.025和0.1 mg/L Cd2+暴露組的“標準化”背角無齒蚌早期幼蚌(EJ4)的心率總體保持一致(P＞0.05)；0.0025 mg/L Cd2+暴露組的心率在72和96 h出現顯著降低(P＜0.05)；0.005 mg/L Cd2+暴露組的心率在72 h出現顯著降低(P＜0.05)；0.5 mg/L Cd2+暴露組的心率在96 h出現顯著降低(P＜0.05)。心率(H)和暴露時間(T)僅在0.0025和0.5 mg/L Cd2+暴露組間呈顯著線性負相關(P＜0.05)。

表1 “標準化”背角無齒蚌早期幼蚌的心率(次/min; Mean±SD; n=30)Tab.1 Heart rates of early juveniles of “standardized”A. woodiana (beats/min; Mean±SD; n=30)

圖2 “標準化”背角無齒蚌早期幼蚌心率與日齡(a)和殼長(b)之間的關系(n=60)Fig.2 Relationships between heart rates and day old (a) as well as shell length (b)of early juveniles of “standardized” A. woodiana (n=60)

圖3 “標準化”背角無齒蚌早期幼蚌心率(n=15)與Cd 暴露時間的關系Fig.3 The relationship between heart rates of early juveniles of “standardized” A. woodiana (n=15) and Cd exposure time

不同暴露時間下，各組別早期幼蚌(EJ4)的心率變化見圖4。其中，暴露24 h 的0.005、0.1 和0.5 mg/L Cd2+暴露組的心率顯著低于對照組(P＜0.05)；暴露48 h的0.5 mg/L Cd2+暴露組的心率顯著低于對照組和其他暴露組(P＜0.05)；暴露72 h 的0.1 mg/L Cd2+暴露組的心率顯著低于對照組(P＜0.05)，0.5 mg/L Cd2+暴露組的心率顯著低于對照組和其他暴露組(P＜0.05)；暴露96 h 的0.5 mg/L Cd2+暴露組的心率顯著低于對照組和其他暴露組(P＜0.05)。貝類對Cd2+暴露的響應較為敏感，容易引起同一組別中心率變幅較大(Liu et al,2016)。盡管如此，Paired t-test 檢驗結果顯示，隨著Cd2+暴露濃度的增加，6 個組別EJ4 的心率(n=15)仍表現為降低趨勢(圖4)，且Pearson 等級相關系數和回歸分析顯示，6 個組別EJ4 的心率(H; n=15)和Cd2+暴露濃度(C)之間呈顯著的線性負相關(P＜0.05; 圖4)。

圖4 “標準化”背角無齒蚌早期幼蚌心率(n=15)與Cd 濃度之間的關系Fig.4 The relationship between heart rates of early juveniles of “standardized”A. woodiana (n=15) and Cd concentrations

3 討論

3.1 早期幼蚌心率規律

貝類心率是反映新陳代謝強度的重要指標(Liu et al, 2016; Bakhmet et al, 2019)。心率變化與生物自身因素(如年齡、規格、晝夜變化)和外界環境因素(如水體理化因子、藻類豐富度)緊密相關(Bakhmet et al,2005、2019; Liu et al, 2016)。本研究在觀察不同生長階段早期幼蚌的心率規律時，所采集的樣本來源相同、所處的外界環境因素一致，因此，心率的差異應歸因于生物自身因素不同。

本研究為背角無齒蚌相關心率重金屬脅迫應答方面的首次探索。結果發現，早期幼蚌的心率總體無明顯的日變化(表1)，表明其新陳代謝強度總體保持一致。然而，早期幼蚌心率與日齡、殼長之間均呈顯著的線性負相關(圖2)，這與紫貽貝(Mytilus edulis)的心率變化趨勢相似(Sukhotin et al, 2017)。日齡和殼長小的幼蚌比日齡和規格大的幼蚌的心率快，這可能與前者的新陳代謝(如生長速率、濾水率)較強有關。Chen等(2015)研究發現，30～60日齡(殼長為1.9～9.1 mm)背角無齒蚌的相對生長率是60～90日齡(殼長為9.1～28.7 mm)的1.4倍，證實日齡和殼長小的幼蚌的代謝強度明顯高于日齡和規格大的幼蚌。貝類等水生生物的濾水率與心率總體呈正相關(Grace et al, 1987; 郭鵠飛等, 2018)。背角無齒蚌的濾水率隨規格的增大而逐漸降低(彭建華等, 2004)，也支持了本研究的上述觀點。隨著日齡和規格的增加，貝類中膜磷脂的不飽和程度降低，從而降低膜的離子通透性，促使新陳代謝效率提高，因而導致心率降低(Sukhotin et al, 2017)。

3.2 早期幼蚌心率對Cd 毒性的響應及預警評估

貝類通過攝食和濾水作用主動或被動的吸收水環境中的Cd (Farris et al, 2007; Pernice et al, 2009)。之后，經過易化擴散、主動運輸或內吞作用，Cd 在有機體內進一步轉運和分配(Farris et al, 2007)。心臟作為貝類循環系統的最重要器官，是Cd 毒性作用的關鍵“靶器官”之一(Bakhmet et al, 2012)。

本研究顯示，背角無齒蚌早期幼蚌(EJ4)的心率和Cd2+暴露時間之間的“時間–效應”關系總體不明顯(圖3)。Martinovi?等(2015)將紫貽貝暴露于4.5 mg/L Cd2+(40 μmol/L CdCl2)水體中，結果顯示，經過24、48和72 h后，紫貽貝的心率未產生明顯變化，與本研究結果相吻合。這可能是由于較大規格的背角無齒蚌(如EJ4)已形成完善的解毒機制，不僅能夠通過緊閉雙殼、減少濾水率和呼吸率以減少對Cd2+的吸收(Farris et al, 2007)，還能夠誘導金屬硫蛋白(MT)的合成來絡合Cd2+進行解毒(Farris et al, 2007)。例如，Li等(2015)發現，Cd2+暴露會引起背角無齒蚌鰓和外套膜中MT顯著增加，且MT含量與Cd積累量呈線性正相關，從而在短時間內避免Cd2+對心率的影響。

值得注意的是，早期幼蚌(EJ4)的心率和Cd2+暴露濃度之間具有顯著的“劑量–效應”關系(圖4)。本研究中，心率和暴露濃度之間呈線性負相關(圖4)，這與牛蛙(Rana catesbiana)心率與水體中Pb2+濃度呈負相關(高波等, 2015)，羅紋貽貝(Geukensia demmissa)心率與水體中多氯聯苯(PCB)、多環芳烴(PAH)濃度呈負相關(Galloway et al, 2002)，香港巨牡蠣(Crassostrea hongkongensis)心率與水體中溶解性重金屬(Cd、Cr、Cu、Ni、Pb 和Zn)總濃度呈負相關的趨勢(Liu et al,2016)一致。當Cd2+的積累量超過貝類解毒能力時，Cd2+就會通過與蛋白質和鈣基因互作并產生氧化損傷，對有機體(如心臟)產生毒性作用(Moulis, 2010)，導致心率降低，研究背角無齒蚌早期幼蚌的心跳頻率對Cd2+濃度的毒性效應特征，有潛力應用于漁業水環境Cd 污染的預警及監測。

綜上所述，本研究首次探索和闡明了“標準化”背角無齒蚌早期幼蚌的心率規律及其對水環境Cd2+暴露的響應特征。早期幼蚌的心率總體沒有明顯的日變化，心率與日齡、殼長之間呈顯著的線性負相關。早期幼蚌的心率對Cd2+較為敏感，雖然心率和Cd2+暴露之間未表現出明顯的“時間–效應”關系，但存在顯著的“劑量–效應”關系。根據早期幼蚌心率對Cd2+的響應特征，有潛力應用于漁業水環境Cd 污染的預警及監測。由于貝類心率可能會受到水溫、pH、水體硬度等因子的影響，在今后的研究中還需要進一步較為系統地探究心率與水質因子之間的關聯性。