基于SSR 標記的刺參不同地理群體的遺傳結構分析及指紋圖譜構建*

廖梅杰 王錦錦 李 彬 王印庚①榮小軍 張 正 范瑞用

(1. 中國水產科學研究院黃海水產研究所 農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室 青島 266071；2. 青島瑞滋集團有限公司 青島 266400)

刺參又名仿刺參(Apostichopus japonicus)，廣泛分 布于太平洋西部的中國、俄羅斯、韓國與日本沿海，具有很高的藥用和營養保健價值，是我國海水養殖中重要的經濟品種(廖玉麟, 1997; FAO, 2012)。近年來，由于過度捕撈和環境污染的加劇，野生刺參自然資源趨于枯竭，刺參已被世界自然保護聯盟收錄到瀕危物種紅色名錄的瀕危(EN)等級(Purcell et al, 2013)。隨著刺參養殖產業和海洋牧場的快速發展，不同地區人工繁育的苗種在各養殖主產區和養殖海域跨地域使用，在自然條件下與原種群相互交配也會造成種質滲透，因此，對刺參原地理種群的種質鑒別日益迫切。

近年來，同工酶(張濤等, 2017)、微衛星DNA 標記(苗貴東等, 2011)、線粒體DNA (Sun et al, 2010;郝君等, 2013)等標記技術在水產種質研究領域被廣泛應用。其中，微衛星DNA 標記又稱SSR 標記，因具有多態性高、遵循孟德爾遺傳規律、可重復性強、共顯性、容易獲得等特點，被廣泛應用于遺傳多樣性研究中。另外，還可充分利用其高多態性的特點構建指紋圖譜，用于品種之間乃至個體之間基因組序列差異解析，用于親緣關系很近的品種或個體的準確辨別(McConnell et al, 1995; Scribner et al, 1996; Dewoody et al, 2000)。本研究利用SSR 標記技術對采自中國、韓國和俄羅斯的8 個不同地理種群刺參進行遺傳結構分析及指紋圖譜構建，以期為刺參種質資源現狀評估和保護提供基礎數據，同時，為后續種質資源鑒定、開發利用和良種選育提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用野生刺參分別采集于中國青島、煙臺，俄羅斯符拉迪沃斯托克，韓國浦項、木浦和群山，共6 個海域，其中，韓國刺參的獲取是在中國水產科學研究院基本科研業務費“中韓漁業聯合研究與合作交流”項目支持下，與韓國海參產業協會合作，完成不同地理群體刺參采集，并由韓方完成DNA 提取；俄羅斯符拉迪沃斯托克地區刺參群體是通過海關相關手續引入。根據所采集刺參體色的差異，韓國浦項采集的刺參又分為紅參、黃參和黑參，合計采集6 個海域8 個不同地理群體刺參225 頭。不同群體的采樣地點及信息見圖1 和表1。

1.2 實驗方法

利用OMEGA Mollusc DNA Kit 提取刺參基因組DNA，利用NanoDrop 1000 及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 純度及完整性后，稀釋到50 ng/μl，置于–20℃冰箱保存備用。利用刺參13 個微衛星位點的引物進行PCR 擴增，對PCR 產物直接進行位點掃描。13 對引物序列見表2，引物由本實驗室設計并驗證，由青島擎科生物公司合成。PCR 反應總體積為20 μl，包含2×TSINGKE Master Mix 10 μl、10 μmol/L 正反向引物各1 μl、模板DNA 1 μl，加ddH2O 補足至20 μl。PCR 反應擴增程序：94℃預變性5 min、94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s，經30 個循環后，72℃延伸15 min，4℃保存。PCR 產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送青島擎科生物公司利用ABI3130 進行擴增片段分型和等位基因分析。

圖1 刺參采樣地點Fig.1 Sampling sites for A. japonicus populations

表1 刺參采樣信息Tab.1 Sampling information for A. japonicus populations

表2 引物序列信息Tab.2 Information of primer sequences

1.3 數據處理

利用Popgene 軟件統計整個群體及各群體的等位基因數(A)、有效等位基因數(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、Nei?s 標準遺傳距離(Ds)、群體間基因流(Nm)，χ2檢驗估計群體Hardy-Weinberg 平衡偏離(Yeh et al, 1997)。利用Cervus 軟件計算各位點多態信息含量(PIC)(Jo et al, 2017)，利用Arlequin 3.5 計算群體間遺傳分化系數(Fst)(Excoffie et al, 2010)。采用Excel 繪制刺參8 個地理群體的指紋模式圖，并根據位點特異性，構建數字化指紋圖譜。使用Structure 2.3中貝葉斯聚類法對所有個體進行聚類分析，K 值設為10，首先根據個體基因型計算各可能自由交配群數K的概率L(K)，再基于相鄰K 概率計算第一級概率變化L′(K)=L(K)–L(K–l)和第二級概率變化L′′(K)=L′(K+l)–L′(K)，獲得L′′(K)絕對值，最后用L′′(K)絕對值除以L(K)標準差得到ΔK(Evanno et al, 2005)。

2 結果與分析

2.1 不同地理種群刺參的遺傳多樣性分析

利用13 對引物對采集的8 個地理種群進行遺傳多樣性分析，結果見表3。13 對引物全部擴增穩定并具有多態性，13 個位點在8 個群體中共檢測出252 個等位基因，單個位點的觀測等位基因數(A)為10(AJ06)～34(AJ07)，平均等位基因數為19.4。各位點的有效等位基因共83.8 個，各位點的有效等位基因數的范圍為1.7(AJ06)～11.8(AJ09)，平均有效等位基因數為6.5。多個位點上的等位基因分布不均勻，表現為低頻等位基因較多，等位基因數和有效等位基因數的差別較大。樣本總的觀測雜合度和期望雜合度分別為0.20(AJ05)～0.83(AJ09)和0.42(AJ06)～0.92(AJ09)，平均值分別為0.47 和0.80。13 個位點的多態信息含量為0.465(AJ06)～0.909(AJ09)，除AJ06 為中度多態性位點(0.25＜PIC＜0.5)外，其余12 個位點均為高度多態性位點(PIC＞0.5)。

表3 各刺參群體在13 個SSR 位點的多樣性指數Tab.3 The genetic diversity indices of 13 SSR markers for different populations of A. japonicus

續表3

不同地理群體分析結果顯示，各群體平均觀測等位基因數為5.5(RU)～10.2(SK-QS-B)，平均有效等位基因數為3.8(RU)～4.9(SK-QS-B)。不同地理群體的觀測雜合度為0.40(RU 和SK-PX-R)～0.54(SK-PX-B)，期望雜合度為0.68(SK-PX-R 和SK-MP-B)～0.76(QD)，8 個群體的多態信息含量(PIC)為0.6392(SK-MP-B)～0.7122(QD)，各群體均顯示為高度多態性(PIC＞0.5)，說明這幾個群體均具有較高的遺傳多樣性。對8 個群體共104 個位點進行Hardy-Weinberg 平衡檢測，結果顯示，有73 個位點顯著偏離Hardy-Weinberg 平衡(P＜0.05)，8 個群體中均有大量位點表現為雜合子缺失狀態(Fis＞0)。

2.2 不同地理種群刺參的指紋圖譜構建

利用13 個微衛星位點在各群體中的擴增結果繪制相應群體的DNA 指紋模式圖。從圖2 可以看出，13 個微衛星位點均具有較高的特異性，每一位點都具有特異性等位基因，相應特異等位基因可用于不同地理群體刺參的鑒別。將這些位點所含有的228 個特異性等位基因進行計算機數字化處理，以“1”和“0”分別表示相應等位基因“有”和“無”，將這13 個微衛星標記產生的特異性多態位點依次排列構建成數字化指紋圖譜(表4)，可為不同地理種群刺參的種質鑒定提供參照。

2.3 不同地理種群刺參的遺傳結構分析

利用Structure 軟件進行群體結構分析的集群K與統計量ΔK 的關系中，ΔK 峰值出現在K=3(圖3)，表明8 個刺參群體的預測自由交配組數為3，因此，后續分群選擇K=3。基于分子標記的個體分配模式顯示(表5)，中國青島群體(95.1%)、煙臺群體(96.9%)樣本中90%以上個體被分配于3 號自由交配群；韓國的5 個群體在1、2、3 號自由交配群中皆有分布，其中，韓國木浦群體主要分布于3 號自由群(67.2%)，其次分布于1 號自由群(31.7%)；韓國群山群體則主要分布于1 號自由群(76.6%)，其次分布于3 號自由群(22.1%)；韓國浦項黃參群體(94.6%)和韓國浦項黑參群體(97.8%)幾乎全部分布于1 號自由群；韓國浦項紅參群體(97.2%)幾乎全部分布于2 號自由群；俄羅斯群體在3 個自由群中皆有分布，在1 號自由群中含78.2%，2 號自由群有4.8%，3 號自由群有16.9%。當K=3 時，貝葉斯分析法的聚類結果見圖4。從圖4可以看出，3 個不同顏色分別代表不同的自由群，紅色代表1 號自由群，綠色為2 號自由群，藍色為3 號自由群。圖4 中不同顏色分布與表5 中的分配比例相一致。自由分配模式表明，不同地理群體刺參遺傳結構與其所在地理位置具有一定的相關性，但又受其他因素影響，導致這種分布模式與地理位置不完全一致。

圖2 8 個群體刺參的微衛星DNA 指紋模式Fig2 DNA fingerprints of eight populations of A. japonicus

圖3 集群K 與統計量ΔK 的關系Fig.3 Scatter plot of possible number of cluster

表5 分配模式檢驗得到的8 個地理群體刺參在3 個自由交配群中的分布比例Tab.5 Distribution proportion of eight geographical populations of A. japonicus in three inferred clusters tested by distribution pattern

圖4 K=3 時貝葉斯分析法的聚類結果Fig.4 Histogram of the Bayesian analysis with K=3

2.4 不同地理種群刺參的遺傳進化分析

不同群體之間的遺傳分化系數及基因流的統計結果見表6。各群體之間存在不同程度的遺傳分化，青島群體與煙臺群體、青島群體與韓國木浦黑參群體、韓國木浦黑參群體與韓國群山黑參群體、韓國群山黑參群體與韓國浦項黃參及黑參群體、韓國浦項黃參與黑參群體的群體間遺傳分化系數較小(0.05＞Fst＞0)，說明以上群體間存在輕度遺傳分化；韓國浦項紅參群體與其他群體間的遺傳分化系數較大(Fst＞0.15)，說明韓國浦項紅參群體與7 個刺參群體間存在高度遺傳分化；青島群體與韓國群山黑參群體、韓國浦項黃參和黑參群體、俄羅斯群體，煙臺群體與韓國群山群體等存在中度遺傳分化(0.15＞Fst＞0.05)。

不同群體間的遺傳距離和遺傳相似指數結果見表7，韓國浦項黑參群體與韓國群山黑參群體的遺傳相似指數最高(Is=0.9279)，遺傳距離最近(DS=0.0749)，而韓國浦項紅參和煙臺群體間的遺傳距離最遠(DS=1.3573)，遺傳相似度最小(Is=0.2574)。聚類分析顯示(圖5)，煙臺群體、青島群體與韓國木浦黑參群體聚為一支，韓國浦項黃參群體、韓國群山黑參群體和韓國浦項黑參群體聚為一支，而韓國浦項紅參群體作為外群，單獨聚為一支。

表6 不同群體間遺傳分化系數值及基因流Tab.6 Genetic differentiation and gene flow between different populations

表7 不同群體間的遺傳距離和相似性指數Tab.7 Nei?s genetic identity and genetic distance in different populations

圖5 不同地理群體的聚類分析Fig.5 UPGMA tree of the eight populations constructed by genetic distance

3 討論

近年來，SSR 標記被廣泛應用于水產動物養殖群體遺傳變異的監測(趙哲霞等, 2014; 程珂等, 2018)、家系鑒別(李雪燕等, 2013)、地理種群遺傳多樣性(傅建軍等, 2015)等研究中。譚杰等(2007)利用微衛星技術分析發現，蓬萊養殖刺參群體遺傳多樣性低于煙臺崆峒島野生刺參群體。高悅勉等(2004)研究發現，大連大孤山、旅順塔河灣、長海縣大長山、海洋島及瓦房店復州灣海域地區野生刺參與大連金州杏樹屯養殖群體遺傳多樣性基本無差別，這可能與該研究采樣樣本的地理區域過于集中有關。本研究利用13 個微衛星位點對8 個不同地理群體225 個刺參個體的遺傳多樣性進行分析。結果顯示，13 個位點在8 個群體中均具有較高的遺傳多樣性，但不同位點又具有一定的差異性。對于不同位點，等位基因數目不等，其中，位點AJ07 在8 個群體中的等位基因數最多，有34 個，而位點C37 的等位基因數最少，有10 個。不同位點樣本的觀測雜合度和期望雜合度也具有一定的差異性，分別為0.20～0.83 和0.42～0.92。這種不同位點等位基因數、觀測雜合度、期望雜合度存在較大差異的現象在刺參微衛星研究中廣泛存在(Zhan et al,2007; 盧超等, 2010)。13 個位點的多態信息含量為0.465～0.909，除AJ06 為中度多態性(0.25＜PIC＜0.5)外，其余12 個位點均為高度多態性(PIC＞0.5)，說明本研究所使用的13 個微衛星位點具有良好的多態性，利用這些位點可更客觀地檢測出不同群體的遺傳差異性。不同地理群體間的平均等位基因數也存在顯著差異，韓國群山黑參平均等位基因數目(10.2)最多，俄羅斯群體最少(5.5)，這可能與其采樣個體較少有關。8 個刺參群體觀測雜合度(Ho)范圍為0.40～0.54，期望雜合度范圍為0.68～0.76，8 個群體的多態信息含量范圍為0.6392～0.7122，各群體均顯示為高度多態性(PIC＞0.5)，說明幾個群體均具有較高的遺傳多樣性。本研究使用的ABI 3730XL 測序儀對等位基因進行分型分析，與以往電泳法讀帶相比，獲得的等位基因大小更精確，因此，每個位點所檢測到的等位基因數目更多，所測定出的群體的遺傳多樣性也更高。

DNA 指紋圖譜技術以其高靈敏度常用于近緣物種鑒別。在水產領域，已應用于羅非魚(Oreochromis)、劍尾魚(Xiphophorus hellerii)、鳊魴魚(Parabramis,Megalobrama)、大口黑鱸(Micropterus salmoides)的群體或品系的鑒定(宋紅梅等, 2009; 全迎春等, 2011;張倩倩等, 2014; 樊佳佳等, 2012)。而在刺參遺傳多樣性研究方面，指紋圖譜應用較少。本研究利用13 個微衛星位點，構建了8 個刺參群體的DNA 指紋數據庫，并根據其等位基因片段大小制成了微衛星DNA指紋模式圖譜，顯示這13 個微衛星位點均具有特異性，可用于不同群體刺參的群體鑒定，可為雜交種和親權鑒定提供參考。

對8 個刺參群體進行遺傳結構分析發現，韓國浦項黑參群體與韓國群山黑參群體的遺傳相似指數最高(0.9279)，遺傳距離最近(0.0749)，而韓國浦項紅參和煙臺群體間的遺傳距離最遠(1.3573)，遺傳相似度最小(0.2574)。聚類分析結果顯示，煙臺群體、青島群體與韓國木浦黑參群體聚為一支，而韓國浦項黃參群體、韓國群山黑參群體和韓國浦項黑參群體聚為一支，而韓國浦項紅參群體作為外群，單獨聚為一支，聚類分析與分群結果相一致。Kim 等(2008)利用9 個微衛星位點研究了韓國5 個地理種群的海參遺傳進化關系，顯示韓國南海海域2 個群體聚為一支，然后與西海海域群體聚在一起，最外側是韓國東海群體，與本研究結果一致。Chang 等(2010)利用微衛星構建系統發育樹發現，日本、韓國及中國大連刺參聚為一支，日本紅參與俄羅斯海參聚為一支；潘傳燕等(2012)研究發現，中國群體與韓國東海岸群體聚為一支，而韓國西海岸群體、俄羅斯群體和日本群體聚為另外一支。這些研究都表明，影響不同地理群體的刺參遺傳分化的因素很多，除了地理位置外，還受海流、季風、氣候、苗種逃逸等影響(譚杰等, 2007a、b)。對韓國浦項地區3 個不同顏色刺參的分析表明，韓國浦項紅參群體的遺傳分化及遺傳結構與其他群體差異較大，說明體色與遺傳關系具有相關性。Kanno 等(2006)利用11 個微衛星位點對日本3 個顏色刺參種群進行物種差異分析，結果顯示，紅色刺參與綠色、黑色刺參之間存在較大遺傳差異，且在聚類分析中，紅色刺參單獨聚為一支，綠色和黑色刺參聚為一支，與本研究結果一致。

本研究利用13 對微衛星引物對6 個海域8 個地理群體的研究發現，各群體均具有較高的遺傳多樣性，并且不同群體刺參遺傳分化結果與其所處的地理位置及其體色具有一定的相關性，是生態環境、海流、地理阻隔相互作用的結果，構建微衛星指紋圖譜可以將8 個群體區分開，相關結果將為刺參種質資源鑒定和挖掘利用提供數據支撐。