三疣梭子蟹14-3-3 基因的克隆及其在低鹽和病原脅迫后的表達分析*

題興斌 呂建建 宋 柳 閻德平 孫東方 劉 萍①

(1. 上海海洋大學水產與生命學院 上海 201306；2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室 青島 266071；3. 農業農村部海洋漁業可持續發展重點實驗室 中國水產科學研究院黃海水產研究所 青島 266071)

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是我國重要的海水養殖經濟蟹(戴愛云等, 1977)。鹽度是三疣梭子蟹養殖中的重要環境因子，直接影響其生長、發育和存活(隋延鳴等, 2012)。夏季暴雨多發，養殖水體鹽度急劇下降，使得三疣梭子蟹體內滲透壓失衡，導致其生長緩慢、成活率較低(孫東方等, 2018)。病害發生也是影響三疣梭子蟹養殖的重要問題，其中，對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是導致三疣梭子蟹死亡的主要病原(Marques et al, 2011; Sullivan et al, 2017)。耐低鹽和抗病性狀是三疣梭子蟹重要的育種性狀，深入研究其低鹽適應和免疫防御的分子機制對培育三疣梭子蟹耐低鹽及抗病良種具有重要意義。

14-3-3 基因是一種廣泛分布于所有真核生物中的高保守基因(Chaudhri et al, 2003)，編碼一組酸性可溶的多功能蛋白，由Moore 等(1967)首次在牛腦細胞中發現。14-3-3 基因的功能具有多樣性，參與生物細胞應激、免疫、細胞周期調控、細胞信號轉導、代謝酶合成、細胞凋亡等多種生理過程的調控(Koskinen et al, 2004; Angrand et al, 2006; Neal et al, 2009; Matta et al, 2012; Rehman et al, 2014; Gómez-Suárez et al,2016; Lu et al, 2017; Yang et al, 2017)。由于其功能的重要性，該基因在擬穴青蟹(Scylla paramamosain)、凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)、斑節對蝦(Penaeus monodon)等多種經濟甲殼類動物中已被克隆，比如在鹽度脅迫過程中，斑節對蝦中14-3-3 基因大量表達(Kaeodee et al, 2011)；在病原感染過程中，凡納濱對蝦中14-3-3 基因呈顯著上調表達(Wang et al, 2007)，初步證明了該基因在抗逆、抗病過程中具重要作用。至今尚未見該基因在三疣梭子蟹中的相關研究報道。

本研究以三疣梭子蟹為對象，通過本實驗室三疣梭子蟹轉錄組測序得到三疣梭子蟹14-3-3 基因片段，對14-3-3 基因在不同組織、低鹽和病原脅迫下的表達情況進行研究。本研究利用RACE 技術，首次克隆三疣梭子蟹14-3-3 基因，通過qRT-PCR 分析其在三疣梭子蟹不同組織中的表達水平，并對其在鹽度脅迫和病原脅迫下的表達變化規律進行研究，以此探討Pt14-3-3 在三疣梭子蟹鹽度適應和免疫反應中的功能，為三疣梭子蟹耐低鹽和抗病品種培育提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所需三疣梭子蟹均取自中國水產科學研究院黃海水產研究所實驗基地濰坊昌邑海豐水產有限公司，體重為(5.78±1.11) g。暫養于4 m×5 m×1.5 m的室內水泥池中，每池90 只，共10 池，暫養7 d。養殖水溫為(25±1)℃，鹽度為33，pH 8.7，持續充氧，每天換水1/3，于18:00 定時投喂藍蛤(Potamocorbula laevis)。隨機選取9 只暫養后健康有活力的三疣梭子蟹，分別取其血細胞、心臟、肝胰腺、鰓、肌肉和眼柄，存于液氮，設3 個平行，每個平行3 只，用于組織表達分布分析。

1.2 實驗方法

1.2.1 鹽度脅迫實驗 隨機挑取暫養7 d 的三疣梭子蟹，分為2 組，對照組(33)和低鹽組(11)(72 h 半致死鹽度)(Han et al, 2014; 隋延鳴等, 2012)，每個處理組設3 個平行，每個平行60 只。使用自然海水和淡水配制低鹽度實驗用水，使用YSI 鹽度儀進行鹽度校準，具體方法見隋延鳴等(2012)。各組分別于脅迫后0、3、6、12、24、48 和72 h 取鰓和肝胰腺組織，液氮速凍保存，用于RNA 的提取，每個時間點取3 只。

1.2.2 病原脅迫實驗 隨機挑取暫養7 d 后體表完整、活力旺的三疣梭子蟹，分成副溶血弧菌注射組和WSSV 注射組，每組50 只，設3 個平行。分別于梭子蟹的游泳足第一關節基膜處注射濃度為3.8×108CFU/ml副溶血弧菌和7.6×107CFU/ml WSSV(謝建軍等, 2011;Ren et al, 2017)。在人工感染后的0、3、6、12、24、48 和72 h 取血細胞和肝胰腺組織，于液氮中速凍保存，用于RNA 提取，每個時間點取3 只。

1.3 Pt14-3-3 基因全長cDNA 的克隆及測序

取三疣梭子蟹鰓、肝胰腺、肌肉等組織樣品，采用TRIzol?Reagent(Invitrogen 公司)方法進行總RNA提取，經 1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(NanoDrop 2000, Thermo)對所提RNA 檢測質量和濃度，將各組織的高質量RNA 均勻混合，使用SmartTMRACE Amplification Kit (TaKaRa 公司)進行3′和5′RACE cDNA 模板的合成。根據從三疣梭子蟹cDNA文庫中獲得的Pt14-3-3 基因的EST 序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設計3′RACE 和5′RACE 特異性引物及RACE 通用引物UPM(表1-1)。使用Advantage 2 PCR Kit(Clontech 公司)進行3′和5′末端的擴增。將獲得的PCR 產物回收純化、連接轉化，挑取陽性單克隆，利用M13-47/48 引物進行菌落PCR 鑒定，篩選目的菌液進行測序。

1.4 序列生物信息學分析

利用Vector NTI 11.0 軟件對測序后的序列進行冗余序列去除和再拼接，通過DNAStar 的EditSeq 程序進行開放閱讀框(ORF)的預測和氨基酸的翻譯。三疣梭子蟹Pt14-3-3 基因的核苷酸序列和推導氨基酸序列使用 BLAST(http://www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行同源性比對。利用ProtParam tool 軟件進行蛋白質理化性質預測，使用InterproScan 軟件進行蛋白質功能結構域分析，TMHMM 2.0 軟件進行蛋白質跨膜區分析。使用ClustalX 軟件對三疣梭子蟹Pt14-3-3 基因的氨基酸序列與其他物種的14-3-3 氨基酸序列進行多序列比對，在此基礎上采用MEGA 4.0軟件，以鄰接法構建系統進化樹。

1.5 Pt14-3-3 的組織表達及各實驗組的表達特征

利用Trizol 試劑提取不同實驗組三疣梭子蟹鰓和肝胰腺組織的總RNA，使用PrimeScript RT reagent Kit 反轉錄合成cDNA。根據已獲得的三疣梭子蟹內參基因β-actin 和Pt14-3-3 基因全長序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設計 2 對正反引物(β-actin-F 和β-actin-R；Q14-3-3-F 和Q14-3-3-R)(表1)，使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑在ABI 7500 Real Time PCR 儀上對不同處理組獲得的Pt14-3-3 基因進行實時熒光定量檢測。熒光定量PCR 反應體系為20 μl：10 μl SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (2×)，0.8 μl 10 μmol/L 的引物Q14-3-3-F，0.8 μl 10 μmol/L 的引物Q14-3-3-R，0.4 μl ROX Reference Dye Ⅱ(50×)，2.0 μl cDNA 模板，6.0 μl 無菌ddH2O。反應程序：95℃ 30 s，95℃5 s，60℃ 34 s，40 個循環；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。采用2-ΔΔCt計算Pt14-3-3 基因的相對表達量，使用SPSS 17.0 軟件進行單因素方差(One-way ANOVA)分析。

表1 本研究中所用引物序列Tab.1 The sequence of primers used in this study

2 結果與分析

2.1 Pt14-3-3 基因cDNA 全長克隆及序列分析

獲得的三疣梭子蟹基因全長為2510 bp，包括93 bp的5′端非編碼區，1676 bp 的3′非編碼區和744 bp 的開放閱讀框(ORF)(圖1)。3′端含有PolyA 尾，具有AATAAA 多聚腺苷酸加尾信號。氨基酸序列分析可知，Pt14-3-3 基因編碼一個由247 個氨基酸組成，理論等電點為4.65，分子量為27.98 kDa 的蛋白。由于其較高的不穩定系數(41.28)和較低的GRAVY(Grand average of hydropathicity) (–0.657)，推斷其為不穩定的親水蛋白。

2.2 Pt14-3-3 基因的同源性及系統進化分析

利用MEGA 4.0 軟件進行系統進化分析顯示，所有物種的14-3-3 共聚為兩大類群：脊椎動物和無脊椎動物；在無脊椎動物中，三疣梭子蟹與中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)緊密聚為一支，同源性為94%，之后的聚類順序依次為與脊尾白蝦(Palaemon carinicauda)、日本對蝦(Marsupenaeus japonicus)、擬穴青蟹、斑節對蝦、墨吉明對蝦(Fenneropenaeus merguiensis)。在脊椎動物和無脊椎動物中，14-3-3 基因在氨基酸序列上都具有高度的保守性，表明該基因在物種間非常保守。

2.3 Pt14-3-3 基因的組織表達

利用實時熒光定量 PCR 分析了三疣梭子蟹Pt14-3-3 基因在不同組織中的表達分布特征，結果顯示，Pt14-3-3 基因在鰓、肝胰腺、肌肉、眼柄、血細胞和心臟中均有表達。其中，在肝胰腺中的表達量最高，其次為肌肉、鰓、心臟和眼柄，而在血淋巴中的表達量最低(圖4)。

2.4 Pt14-3-3 基因在低鹽脅迫中的表達

Real-time PCR 檢測了三疣梭子蟹在低鹽脅迫后不同時間點的鰓和肝胰腺中Pt14-3-3 基因的相對表達情況(圖5)。低鹽脅迫后，Pt14-3-3 基因在鰓中的相對表達量與對照組相比，于3～24 h 呈現顯著下調表達，48～72 h 為顯著上調表達，分別于6 h 和48 h達到最小值和最大值，為對照組的0.24 倍(P＜0.05)和1.34 倍(P＜0.05)。低鹽脅迫后，Pt14-3-3 基因在肝胰腺中的相對表達量與對照組相比，除6 h 外，整體呈上調表達，表達趨勢為先上升、下降后再上升、下降，于12 h 達到最大值，為對照組的7.54 倍(P＜0.05)。

圖1 三疣梭子蟹14-3-3 基因核苷酸序列及其推導的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and deduced amino acids sequence of P. trituberculatus 14-3-3 gene

2.5 Pt14-3-3 基因在病原脅迫中的表達

實時熒光定量PCR 檢測了三疣梭子蟹在病原脅迫后不同時間點的肝胰腺和血細胞中Pt14-3-3 基因的相對表達情況(圖6)。感染副溶血弧菌后，Pt14-3-3基因在肝胰腺中相對表達量與對照組相比，整體呈顯著上調表達，分別于12 h 和48 h 達到最大值和最小值，為對照組的17.52 倍(P＜0.05)和1.77 倍(P＜0.05)；在血細胞中的相對表達量與對照組相比，除6 h 外，整體呈下調表達，分別于6 h 和12 h 達到最大值和最小值，為對照組的1.68 倍(P＜0.05)和0.04(P＜0.05)倍。感染WSSV 后，Pt14-3-3 基因在肝胰腺和血細胞中的相對表達量與對照組相比，除24 h 外，整體均呈上調表達，分別于72 h 和3 h 達到最大值，為對照組的13.35 倍(P＜0.05)和3.25 倍(P＜0.05)，均于24 h 降至最小值，分別為對照組的0.52 倍(P＜0.05)和0.42 倍(P＜0.05)。

3 討論

圖2 三疣梭子蟹Pt14-3-3 氨基酸序列與其他物種14-3-3 氨基酸序列比對Fig.2 Amino-acid sequences alignment of P. trituberculatus with different animals′ 14-3-3 genes

圖3 利用MEGA 4.0 軟件構建的基于14-3-3 氨基酸序列的NJ 系統進化樹Fig.3 NJ tree based on 14-3-3 gene amino acid sequences using MEGA 4.0

圖4 三疣梭子蟹Pt14-3-3 基因在各組織中的表達Fig.4 Distribution of Pt14-3-3 gene expression in different tissues of P. trituberculatus

本研究克隆得到三疣梭子蟹14-3-3cDNA 全長序列，編碼由247 個氨基酸組成的蛋白質。14-3-3 基因具有高度的保守性，將本研究克隆得到的三疣梭子蟹14-3-3 基因與其他進行比對，Pt14-3-3 基因與中華絨螯蟹14-3-3 基因同源性最高，達到100%；聚類分析顯示，三疣梭子蟹14-3-3 基因氨基酸序列與中華絨螯蟹緊密聚為一支，之后依次與脊尾白蝦、日本對蝦、擬穴青蟹、斑節對蝦、墨吉明對蝦聚在一起，同源性均在95%以上。研究發現，14-3-3 基因在哺乳動物中存在β、γ、ε、η、σ、ζ 和θ 7 種亞型(Hermeking, 2003)。根據NJ 系統進化樹和氨基酸比對結果，對Pt14-3-3基因進行分析，推測該基因屬于ζ 亞型，三疣梭子蟹是否存在14-3-3 基因的其他亞型有待進一步研究。

本研究采用熒光定量RT-PCR 方法對三疣梭子蟹14-3-3 基因mRNA 組織表達進行分析。顯示14-3-3基因在多種組織中都有表達，暗示該基因功能的多樣性。在肝胰腺中的表達量最高，推測肝胰腺為三疣梭子蟹14-3-3 基因發揮作用的重要器官，而肝胰腺是機體參與免疫防御的重要組織，暗示了該基因具有免疫功能。該結果與擬穴青蟹14-3-3 基因表達的研究結果基本一致(舒妙安等, 2012)。血細胞是三疣梭子蟹重要的免疫細胞，Pt14-3-3 基因在血細胞中有少量表達，同樣說明其具有免疫功能(Kaimin et al, 2017)。例如，Chongsatja(2010)等研究發現，凡納濱對蝦病原感染后14-3-3 基因在血細胞中大量表達，證明了該基因的免疫功能。另外，在鰓中也有較多表達，鰓組織與滲透壓調節密切相關(Lü et al, 2013; Genovese et al,2004)，暗示其可能的在鹽度適應中發揮一定的功能。例如，Kaeodee 等(2011)發現，斑節對蝦從高滲到低滲的適應中14-3-3 基因大量表達，證明該基因參與機體滲透壓的調節。

圖5 Pt14-3-3 基因在低鹽脅迫下鰓和肝胰腺中的表達情況Fig.5 Expression of Pt14-3-3 gene in gill and hepatopancreas under low salt stress

圖6 Pt14-3-3 基因在病原脅迫下肝胰腺以及血細胞中的表達Fig.6 Expression of Pt14-3-3 gene in hepatopancreas and blood cells under pathogen stress

為了探究Pt14-3-3 基因在三疣梭子蟹鹽度適應中是否具有一定功能，本研究分析了該基因在低鹽脅迫下鰓和肝胰腺中的表達規律。發現低鹽脅迫后，Pt14-3-3 基因在鰓組織中0～24 h 呈顯著下調表達，推測原因可能是低鹽脅迫導致鰓組織產生應激損傷，最終間接干擾或抑制了Pt14-3-3 基因的表達；48 h 后基因表達上調，暗示了三疣梭子蟹通過顯著上調鰓組織中Pt14-3-3 基因的表達量來應對低鹽脅迫。Kammerer等(2009)研究認為，鹽度脅迫下羅非魚鰓上皮細胞凋亡數量隨時間的延長而增加。Pt14-3-3 基因屬于ζ 亞型，具有凋亡抑制的功能(陳惠華等, 2005)。以上研究表明，三疣梭子蟹可能通過上調Pt14-3-3 基因的表達來抑制鰓組織中細胞凋亡的過程。低鹽脅迫后，Pt14-3-3 基因在肝胰腺中于3 h 后呈上調表達，暗示三疣梭子蟹通過上調肝胰腺中Pt14-3-3 基因的表達量來抑制肝胰腺中的細胞凋亡進程，來參與環境的適應性調節。

注射副溶血弧菌和 WSSV 病毒后，肝胰腺中Pt14-3-3 基因的表達量整體上調，基本呈先上升后下降再上升的表達趨勢，上升趨勢表明Pt14-3-3 基因可能參與了三疣梭子蟹的免疫應答反應，通過增加Pt14-3-3 基因的表達協助清除受損細胞，來維持其正常生理功能(Chang et al, 2008)。下降趨勢表明，機體可能處于感染后的恢復期，而再次的上升趨勢則可能是三疣梭子蟹恢復期后繼續清除殘留的副溶血弧菌和WSSV 病毒的表現。2 種致病病原導致的Pt14-3-3基因在肝胰腺中的表達到達最大值的時間不同，可能是由于三疣梭子蟹對于2 種病原的敏感程度和耐受程度不同。感染副溶血弧菌后，三疣梭子蟹14-3-3基因在血細胞中的表達量呈先下降再上升再下降的趨勢，該趨勢與脊尾白蝦感染WSSV 病毒后14-3-3基因(王有昆等, 2016)在血細胞中的變化趨勢及凡納濱對蝦感染桃拉病毒后14-3-3 蛋白(Chongsatja et al,2010)的變化趨勢相一致，表明三疣梭子蟹可能通過上調14-3-3 基因的表達來抑制肝胰腺和血細胞中的細胞凋亡進程，來參與三疣梭子蟹的免疫應答反應。

本研究成功克隆了三疣梭子蟹14-3-3 基因cDNA全長，初步探究了該基因在三疣梭子蟹低鹽適應中鰓和肝胰腺中的表達模式以及感染副溶血弧菌和WSSV 病毒后在肝胰腺和血細胞中的表達模式，證明Pt14-3-3 基因在三疣梭子蟹低鹽適應和免疫應答反應中發揮了作用，為進一步研究三疣梭子蟹14-3-3基因在低鹽適應中的分子機制及其免疫機制研究和病害防治提供了理論依據。