中國對蝦NAGase 基因SNP 標記的篩選及與耐高pH 性狀的關聯分析*

韓 旭 何玉英 李 健 張海恩 周雨欣

(1. 上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心 上海 201306；2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋漁業科學與食物產出過程功能實驗室 青島 266071；3. 中國水產科學研究院黃海水產研究所農業農村部海水養殖病害防治重點實驗室 青島 266071)

pH 是反映水體水質狀況的一個重要指標，正常海水pH 值一般維持在7.8～8.5，養殖過程產生的殘餌及糞便會增加水體的氮磷營養鹽含量，使養殖水體富營養化，藻類隨之會產生過度的光合作用，水污染、極端天氣等都會造成海水pH 值升高(Herbeck et al,2013; 李瑞萍等, 2015; Li et al, 2019)。pH 是養殖過程中主要的非生物脅迫因子之一，當水體pH 偏離水生生物生存的適宜范圍，會引起水生生物的應激反應，特別是持續較高pH 刺激會增加水生生物的抗氧化酶活性(王蕓等, 2011)，引起嚴重的細胞凋亡(Li et al,2019)和生物DNA 損傷(Wang et al, 2009)，生物體內的Na+/H+交換體(NHE) (李政道等, 2018)、質子泵(H+-ATPase) (胡碩等, 2019)、碳酸酐酶(Carbonic anhydrase,CA) (Liu et al, 2015)等相關離子調控酶的活性發生改變，進而導致對蝦生長緩慢、免疫力降低，感染疾病的幾率增加(Li et al, 2008)。

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)又稱殼二糖酶，是幾丁質酶系的一種(Broadway et al, 1995)，在免疫、蛻皮和消化幾丁質食物中發揮重要作用(Xie et al, 2010)，經常作為氧化應激反應的指示酶(Gabai et al, 2004; Corsi et al, 2010)。呂艷杰等(2018)研究表明，1-苯甲基-5-[(E)-2,6-二甲基-1,5-庚二烯](KK-42)處理會加速日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)NAGase 酶活力的表達，加快舊表皮的降解，從而縮短對蝦蛻皮周期；Sun 等(2018)研究發現，脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda) NAGase 主要在表皮和肝胰腺中表達，且在蛻皮期表達量最高。在高pH 環境下，水體中的金屬離子的溶解會受到影響(Tucker et al,2008)。Xie 等(2009)研究發現，Zn2+通過與組氨酸或半胱氨酸殘基結合，會改變凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)NAGase 酶的活性和構象。Mesquita 等(2015)研究鎘處理的青蟹(Carcinus maenas)，其能夠通過NAGase 酶的螯合作用增強其耐受性。Latif 等(1994)和劉金生等(2016)研究表明，在高堿環境下，甲殼動物蛻皮更頻繁。由此推測，在高pH 脅迫下，中國對蝦NAGase 也參與一定的免疫調控作用。

單核苷酸多態性位點(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)是指在基因組水平上由于單個核苷酸突變使得DNA 序列的多態性增加(Wang et al, 1998)。SNPs 作為遺傳標記有位點數量多、多態性豐富(Kwok et al,1996)、能穩定遺傳、能聯合GWAS 進行分析及檢測方法簡單、快速的優勢(Yang et al, 2012)。SNP 作為DNA 分子標記在很多水產動物研究中得到應用，如海灣扇貝(Argopecten irradians) (Meng et al, 2017)和文蛤(Meretrix meretrix) (Dai et al, 2017)的生長性狀，斑馬魚(Danio rerio)的低溫耐受性(王倩等, 2015)、凡納濱對蝦的繁育性狀(王冉等, 2018)、羅氏沼蝦的免疫力(唐修陽等, 2019)，中國對蝦抗WSSV 能力(逄錦菲等, 2013)等性狀相關SNP 標記的篩選，但有關中國對蝦耐高pH 脅迫的SNP 標記篩選未見報道。

本研究基于高pH 脅迫中國對蝦的轉錄組數據庫篩選出響應高pH 脅迫的基因——NAGase，對該基因預測的52 個SNP 位點進行篩選、驗證及與耐高pH性狀的關聯分析，以期獲得與耐高pH 性狀相關的SNP 標記，為中國對蝦耐高pH 性狀新品種(系)的培育提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用中國對蝦“黃海3 號”來自山東省濰坊昌邑市海豐水產養殖有限責任公司，體長為(7.25±1.32) cm，體重為(4.75±2.42) g，約400 尾，置于室內養殖池暫養7 d，暫養期間連續充氣，每天按時換水清污，換水量約為總體積的1/3；每天按照中國對蝦體重的5%投喂配合飼料，定時投喂2 次。實驗期間，海水溫度為27℃～30℃，鹽度為32～35，pH 8.14～8.22。

在4 m×2 m 的水泥池中，使用1 mol/L 的NaOH調節海水pH。整個實驗期間，每日定時采用YSI 水質分析儀測定并及時校正海水pH 至9.3，變化幅度不超過0.05。當海水的pH 相對穩定時開始實驗。實驗期間，將400 尾對蝦放入實驗池中，觀測對蝦存活、攝食及活動情況，發現身體側躺、對外界刺激沒有反應時，及時撈出。脅迫實驗早期死亡的48 尾和后期死亡的48 尾對蝦分別作為敏感組和抗性組。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA 的提取 采用傳統的酚–氯仿法提取中國對蝦肌肉基因組DNA，用超微量紫外可見分光分析儀與1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質量，稀釋至30 ng/μl，置于–20℃冰箱中備用。

1.2.2 直接測序法篩選中國對蝦NAGase 基因SNP位點 在NCBI 庫中查找中國對蝦NAGase 基因登錄號為DQ280379.1，總長為2197 bp，其中，ORF為1902 bp，5?非編碼區(5?-UTR)為70 bp，3?非編碼區(3?-UTR)為225 bp，編碼633 個氨基酸。利用Primer 5.0 軟件設計擴增FcNAGase 序列全長的引物，要求擴增的相鄰PCR 產物有重疊的部分，以確保內含子部分的有效擴增，進而篩選到FcNAGase 上全部的SNP 位點。共設計11 對引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，擴增成功引物信息見表1。

1.2.3 PCR 擴增和產物檢測 隨機選取高pH 脅迫敏感組和抗性組各6 個樣品DNA 進行混合，作為PCR 反應的模板，用2×Taq Plus Master Mix Ⅱ(Dye Plus)酶(南京諾唯贊)進行擴增。PCR 體系總體積20 μl，酶10 μl，上下游引物各1 μl (10 μmol/L)，混合模板2 μl，去離子水6 μl。反應程序：94℃預變性4 min；94℃變性30 s，退火1 min，72℃延伸40 s，共30 個循環；72℃終延伸10 min。PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，挑選明亮且單一的條帶送生工生物工程(上海)測序。

1.2.4 測序結果及SNP 位點的初步確定 測序結果使用軟件ContigExpress 進行拼接，確定是否有內含子存在，是否符合GT-AG 原則；根據測序結果的峰圖，清晰且有明顯雙峰的位點，即為潛在的SNP 位點。

1.2.5 熒光定量PCR 法(qPCR)驗證及位點分型

通過qPCR 生長曲線和熔解曲線的結果進行SNP分型，參考單志新等(2005)基于熒光定量PCR 擴增反應的SNP 測定方法，在2 條特異性引物的3?端倒數第3 位引入錯配的堿基。根據潛在的SNP 位點設計特異性引物，隨機抽取的12 個DNA 樣品作為模板進行定量PCR 反應，驗證特異性引物是否有效擴增，可以用于分型的特異性引物見表2。

表1 普通PCR 引物設計Tab.1 List of common PCR primers

PCR 體系總體積10 μl：酶5 μl，Dye2 為0.2 μl，模板 DNA 4 μl (30 ng/μl)，上下游引物各 0.4 μl(10 μmol/L)。反應程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃35 s，72℃ 40 s，共40 個循環；95℃ 15 min，60℃ 1 h，95℃ 15 min。qPCR 引物驗證，以P2 (T206G)點為例，由熔解曲線(圖1)可知峰圖單一，沒有其他雜峰，可判定P2 的特異性引物組可以進行有效擴增。用此標準驗證其余組特異性引物。由產物的Ct值大小(圖2)來判斷位點的基因型，當二者Ct差值大時，Ct小的即為SNP 特異性引物對應堿基的純合，當二者Ct接近或差值小于3 時即為雜合子。紅色和黃色的生長曲線分別為特異性引物P2m、P2w 分別與P2r 組合的結果見圖2，對應基因型分別為TT、GG 和GT。成功分型的特異性引物組信息見表2。用敏感組和抗性組各48 個樣品進行SNP 位點的定量分型。

1.2.6 SNPs 位點的多樣性分析及與耐高pH 性狀的關聯分析 根據SNPs 位點的分型結果，統計各基因型頻率和基因頻率，以PopGene 32(Ver 1.31)和PIC-Calc 0.6 軟件計算觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、最小等位基因頻率(MAF)、有效等位基因數(Ne)和哈迪–溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)等遺傳多樣性的指標，根據Botstein 等(1980)劃分的原則，低度多態性 PIC＜0.25，中度多態性0.25＜PIC＜0.50，高度多態性PIC＞0.50。利用SPSS 17.0對分型結果進行卡方檢驗，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

圖1 FcNAGase 的P2(T206G)位點的熔解曲線Fig.1 Melting curve plots of FcNAGase P2(T206G)

2 結果

2.1 基因組DNA 提取結果

敏感組和抗性組各48 個樣品提取DNA，電泳結果如圖3 所示，主帶清晰、完整，無雜帶及拖帶現象，滿足后續實驗要求。

2.2 SNP 位點的初步篩選

利用混合模板進行普通PCR 擴增，共擴增出6條條帶(圖4)，條帶明亮，其中，條帶2 與預期產物長度相同，其余5 個擴增產物均超出預期的產物長度。將PCR 產物及所對應的引物送生工生物工程(上海)測序。

表2 熒光定量PCR 引物設計(特異性引物)Tab.2 Primers for real-time PCR (specific primer)

圖3 中國對蝦基因組DNA 電泳圖譜Fig.3 Gel electrophoresis of F. chinensis genome DNA

圖4 PCR 產物的電泳圖譜Fig.4 Gel electrophoresis of PCR products

將測序結果利用ContigExpress 軟件進行拼接，FcNAGase 的開放閱讀框(ORF)的DNA 序列全長為2544 bp，包含5 個外顯子和4 個內含子。且外顯子和內含子邊界都符合GT-AG 原則。由Gene Structure Display Server 2.0 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制關于外顯子–內含子的具體位置(圖5)。

根據測序結果的峰圖，將出現雙峰的位點作為初步篩選SNP 位點的依據，共篩到29 個潛在的SNP位點。以No.2 引物的產物為例，截取反向測序結果的峰圖，圖中箭頭標出的對應位點是P2，從測序結果看出，峰圖清晰，無雜峰(圖6)。

根據測序峰圖及拼接結果可知，共篩選到29 個潛在的SNP 位點，其中，20 個為外顯子突變，9 個為內含子突變，SNP 位點分布頻率為1.13/100 bp，其中，內含子的突變頻率為0.35/100 bp，外顯子的突變頻率為0.78/100 bp。

2.3 qPCR 分型結果

對29 個潛在的SNP 位點用特異性引物進行熒光定量PCR 分型，有14 個SNP 位點分型成功，具體信息見表3。外顯子區域中的突變存在2 個錯義突變，分別為P2 位點由Ser(絲氨酸)突變為Ala(丙氨酸)，P9 位點由Phe(苯丙氨酸)突變為Leu(亮氨酸)，其余外顯子上的位點均為同義突變。

2.4 FcNAGase 的SNP 位點多態性分析

FcNAGase 的14 個SNP 標記的多態性分析結果見表4。觀測雜合度(Ho)為0.1981～0.939，期望雜合度(He)為 0.0595～0.499，多態信息含量(PIC)為0.0574～0.3731；哈迪–溫伯格平衡檢驗(HWE)結果表明，P21、P27 和P29 位點極顯著(P＜0.01)偏離哈迪–溫伯格平衡，其余11 個SNP 位點均符合哈迪–溫伯格平衡。其中，P9、P14 和P18 位點為低度多態性，其余11 個SNP 位點為中度多態性，從多態性參數上能夠看出，選用的中國對蝦人工選育群體“黃海3 號”的遺傳多樣性較為豐富，可進行后續的關聯性分析。

圖5 FcNAGase 基因全長Fig.5 Nucleotide sequence of FcNAGase

圖6 引物No.2 反向測序結果(部分)Fig.6 Primer No.2 reverse sequencing results (partial)

表3 SNP 位點的具體信息Tab.3 SNP site specific information

2.5 FcNAGase 的SNP 位點與耐高pH 性狀的關聯分析

利用SPSS 進行卡方檢驗，分析14 個SNP 位點的基因分型結果與耐高pH 性狀之間的關聯性，結果見表5。有的樣品數少于48 個，由實驗誤差引起，在眾多樣品中所占比例較小，不影響數據分析。卡方檢驗結果表明，P12 和P27 位點與中國對蝦耐高pH 性狀相關(P＜0.05)；P21 和P29 位點與中國對蝦耐高pH 性狀無顯著關系，但這2 個位點偏離哈迪–溫伯格平衡，表明在中國對蝦“黃海3 號”選育群體中受到了選擇。

3 討論

本研究基于高pH 脅迫的中國對蝦的轉錄組數據庫，篩選出響應高pH 脅迫的NAGase 基因，通過直接測序法獲得了FcNAGase 的開放閱讀框(ORF)，全長為2544 bp，由5 個外顯子和4 個內含子組成，與脊尾白蝦EcNAG (Sun et al, 2018) 5 個外顯子和4 個內含子的結果一致。本研究首次在中國對蝦中應用熒光定量法進行位點分型的方法，成功得到14 個SNP位點的基因型，約占潛在位點的50%，推測剩余位點未分型成功的原因：一是相鄰2 個SNP 位點位置距離近，影響特異性引物的設計；二是人為引入的錯配堿基，提高了引物的特異性，可降低SNP 位點分型的假陽性，但也會因為特異性太高，使得引物不能成功擴增出特異條帶，導致位點不能成功分型，所以該方法并不是對所有的SNP 位點都能適用。但是，該方法簡單快速，約1 h 即可完成48 個DNA 樣品的分型，僅需要根據Ct值的大小即可判斷分型結果。

表4 SNP 位點基因多態性分析Tab.4 The analysis of gene polymorphism of SNPs

表5 SNP 位點與耐高pH 性狀的關聯分析Tab.5 The correlation analysis of SNP loci with anti-high pH traits

分型成功的14 個SNP 位點與耐高pH 性狀的關聯性分析顯示，位點P12 與P27 存在顯著相關性(P＜0.05)。P21 和P29 極顯著偏離哈迪–溫伯格平衡(P＜0.01)。可能的原因，一是中國對蝦“黃海3 號”是經過人工多代選育的品種，會影響堿基頻率；二是進行高pH 脅迫實驗的400 尾對蝦，根據死亡時間劃分敏感組和抗性組，提取DNA 的樣品是分層的，因此不符合哈迪–溫伯格平衡。P21 位于外顯子2，P27 和P29 位于外顯子3，均屬于同義突變。同義突變并沒有在翻譯過程中改變氨基酸的種類，但會以其他方式影響蛋白質的翻譯過程，如：在mRNA 的水平上影響增強子的功能，引起周邊外顯子剪切出現跳躍或者移碼，使得蛋白質序列縮短(楊軍等, 2017)，以及蛋白質二級結構的改變(Shen et al, 1999)，mRNA 翻譯速度的調整(Komar, 2007)等。P2 位點是絲氨酸(Ser)與丙氨酸(Ala) 2 種氨基酸的改變，Ser 是極性不帶電荷的氨基酸，Ala 是非極性氨基酸，會影響親水性，導致蛋白質水溶性發生改變，具體對中國對蝦耐高pH 性狀的影響還需要進一步研究；P9 位點是苯丙氨酸(Phe)與亮氨酸(Leu) 2 種氨基酸的改變，Phe 與Leu均為非極性氨基酸，對NAGase 蛋白的三維構造不會產生很大影響，從而不會對蛋白相應功能產生很大改變。

pH 作為影響對蝦生長的重要非生物因子之一，pH 值異常會嚴重影響對蝦的體內細胞及整體水平上的pH 平衡和相關離子的穩態(胡碩等, 2019)，培育高pH 耐受性的對蝦新品種是解決這一問題最直接的手段。陳華增等(2011)篩選得到中國對蝦耐高pH 負相關2 個SRAP 標記，正相關5 個SRAP 標記。SRAP是將序列特征性片段進行擴增，SNP 標記與SRAP 標記相比，出現頻率高，多態性豐富，操作流程簡單，可進行大批量樣品的篩選。可以利用SNP 位點的多態性，篩選與抗逆性狀關聯的SNP 標記：李西雷等(2012)研究三角帆蚌(Hyriousis cumingii)的GPX基因篩選得到8 個SNP 位點與抗病性狀存在顯著性差異；薛寶寶等(2019)研究縊蟶(Sinonovacula constricta)的HSP70 基因，3 個SNP 位點可作為耐高溫遺傳育種的候選分子標記。本研究獲得2 個耐高pH 性狀的分子標記。

耐高pH 性狀是由多基因調控的數量性狀，可以結合中國對蝦高pH 轉錄組中其余組分的數據結果，如：差異表達量、GO 分類、COG 分類注釋和代謝通路注釋(KEGG pathway)等(周賀等, 2014)，繼續進行耐高pH 性狀的SNP 位點標記的篩選工作。本研究中，與中國對蝦耐高pH 的顯著相關的P12 和P27 標記需要在不同遺傳背景群體中驗證；有關FcNAGase 的啟動子區也可以再進一步擴增加以研究，例如甲基化、SNP 位點的篩選等，以期作為重要的分子標記在中國對蝦耐高pH 性狀分子標記輔助育種中發揮作用，結果有助于中國對蝦耐高pH 育種提供理論依據和資料。